苏云金芽胞杆菌cry8Ea启动子区orf1片段缺失增强启动子活性

本文分别构建了cry8E基因上游的启动子(Porf18E)和其上游缺失orf1基因的启动子(PΔorf18E)融合lacZ基因的表达载体,通过β-半乳糖苷酶活性的分析,发现PΔorf18E的转录活性高于Porf18E。分别用PΔorf18E和Porf18E指导cry1Ac基因的表达,通过光学显微镜观察,发现两个启动子指导表达的Cry1Ac蛋白均可形成双锥形晶体;通过总蛋白定量分析发现,缺失orf1基因的启动子(PΔorf18E)指导的Cry1Ac蛋白表达量高于Porf18E启动子指导的Cry1Ac蛋白表达量;生物活性测定表明:PΔorf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾Plutella xylostella具有杀虫活性,高于Porf18E指导的Cry1Ac晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性。本文获得的强活性的启动子PΔorf18E是目前已报道的转录活性最高的cry基因启动子,该启动子为Cry蛋白的表达和遗传工程菌株构建提供了重要元件。     

Bt cry序列本地数据库的建立及本地BLAST的实现

根据研究的实际需要,运用winSDK设计了一个可视化的BLAST接口程序,利用此程序可以构建本地核酸和蛋白序列数据库与进行本地BLAST。在此基础上建立了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry基因的本地核酸序列数据库,并进行了本地BLAST。与先前文献中介绍的本地BLAST实现的方法相比,此方法操作简便、并可根据实际需要随意定制相关数据库;在与NCBI的BLAST进行比较后发现,本地BLAST还具有个性化、准确性强、可信度高等特点。     

咪唑乙烟酸降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

采用高压富集方法,从生产咪唑乙烟酸农药厂排污口污泥中分离得到1株咪唑乙烟酸高效降解菌P14,根据菌株形态、生理生化特性及16S rDNA分析,鉴定该菌株为哈夫尼希瓦氏菌Shewanella hafniensis。初步研究了其在不同条件下对咪唑乙烟酸的降解性能。结果表明:在以咪唑乙烟酸为唯一碳源的无机盐培养基中,当咪唑乙烟酸初始质量浓度为100 mg/L、培养温度为30 ℃、pH值6.0、接种量7%时,菌株P14对咪唑乙烟酸的降解效果最佳,3 d内的降解率可达92%,因而可以此作为菌株P14降解咪唑乙烟酸的最佳条件。外加不同碳源时,P14菌株对咪唑乙烟酸的降解率呈现不同程度下降,其中柠檬酸钠对P14菌株降解效果影响较小。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

苏云金芽孢杆菌及其δ-内毒素基因的分类与鉴定

苏云金芽孢杆菌作为重要的杀虫微生物在生物防治中发挥了巨大作用。其分类鉴定对于研究资源的多样性、快速筛选优良菌株、预测其杀虫活性、分离克隆新的Btδ-内毒素基因等方面具有重要意义。本文对Bt菌株的分类、δ-内毒素基因分类、鉴定方法进行了分析讨论。     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

苏云金芽孢杆菌HBF-1菌株对铜绿丽金龟和 黄褐丽金龟幼虫生长发育及取食的影响

研究了苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HBF-1菌株对10日龄铜绿丽金龟Anomala corpulenta和黄褐丽金龟A.exoleta幼虫存活率、拒食、抑制生长及取食选择性的影响。结果表明,随着感染剂量的增大和感染时间的延长,两种金龟子幼虫的存活率均下降,对铜绿丽金龟幼虫的拒食作用和生长抑制作用增强,使该幼虫对饲料的选择性增强。感染7 d时,对黄褐丽金龟幼虫的LC50值为64.16 μg/g,14 d时下降到13.98 μg/g,对铜绿丽金龟幼虫的LC50值则由79.69下降到19.14 μg/g。当菌剂浓度为10 μg/g、感染7 d时,HBF-1菌株对铜绿丽金龟幼虫的拒食率和生长抑制率分别为4.74%和9.84%,14 d时分别为30.75%和73.87%;当菌剂浓度达到160 μg/g、感染7 d时,对铜绿丽金龟幼虫的拒食率和生长抑制率分别为39.01%和83.61%,14 d时分别为86.10%和97.75%。可见高浓度菌剂对铜绿丽金龟幼虫有一定的拒食作用。     

苏云金芽孢杆菌菌株B-Pr-88的生物学特性

就自行分离的、对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88的生物学特性进行了系统研究.B-Pr-88可形成菱形、球形和不规则形等多种形态的晶体,主要由130kDa和60kDa两种蛋白组成;酯酶型与标准菌株蜡螟亚种和库斯塔克亚种一致,同属于galleriae型;10项生理生化反应结果表明,B-Pr-88与标准菌株蜡螟亚种反应一致;B-Pr-88菌株至少含有3种大小不同的质粒,经PCR-RFLP鉴定该菌株至少包括cry2Ab、cry9Ba和多种cry1(包括cry1Cb、cry1Db、cry1Fb和cry1Gb)等6种不同的杀虫晶体蛋白基因.