Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。     

狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的狂犬病病毒G基因序列,设计合成了1对特异性引物,对RV ERA株G基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接得到重组质粒pMD-G,并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1 575bp,编码524个氨基酸。与GenBank中已发表的其他RV标准毒株(CVS,PV,SRV9,SAD-B19)相比,G基因核苷酸的同源性为89.1%～99.1%,推导的氨基酸序列的同源性为89.7%～99.3%。对推导的RV ERA株G蛋白氨基酸序列分析表明,该蛋白含有3个潜在的N-联糖基化位点。用DNAStar软件对RV ERA株与CVS、SRV9、PV、SAD-B19等G蛋白疏水性、Jame-son-Wolf抗原表位和表面极性分析表明,它们之间非常相似。     

狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区真核表达载体的构建及其在DK细胞中的表达

为了研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)糖蛋白(rgp)膜外区在以糖蛋白为免疫原的免疫应答中的作用,提取RV的RNA,通过RT-PCR扩增RV糖蛋白膜外区1375 bp的序列,将其克隆入pMD18-T载体中,经测序比对正确后,通过酶切将其亚克隆入pVAX1表达载体的多克隆酶切位点处,将酶切鉴定正确的阳性重组子命名为pVAX-rgp,构建表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的真核表达载体,在质脂体介导下转染DK细胞观察其表达情况。研究结果表明,经免疫荧光和Western blotting鉴定,有特异性荧光和60 ku条带产生,证明pVAX-rgp载体中的rgp可在DK细胞中表达。本研究通过成功构建狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区的真核表达载体,为下一步有关功能基因组的研究和基因疫苗的研制奠定了基础。     

P-Ⅲ型分布在设计潮位中的应用

以实测潮位资料为依据,对海河口潮位进行数理统计分析,按P-Ⅲ型分布和Gumbel型分布给出了不同频率设计潮位,同时对2种分布型的计算精度进行统计研究。结果表明:P-Ⅲ型设计拟合效果较优,对设计潮位的分析计算具有重要的参考价值。     

菲律宾蛤仔糖蛋白提取及体外抗肿瘤活性研究

以菲律宾蛤仔肉为研究对象,水提醇沉,Sevag法除蛋白,DEAE—SepharoseFF阴离子交换层析柱分离纯化,SephadexG-25凝胶柱除盐,得到1种白色组分,红外显示该组分具有糖蛋白的一般吸收特征。将该糖蛋白作用于前列腺癌细胞DU-145进行体外药物敏感性实验,结果显示,0．1moFL氯化钠溶液的洗脱峰组分对DU-145细胞具有明显增殖抑制作用。最适作用浓度约为25mg／mL,表明菲律宾蛤仔具有潜在的抗肿瘤作用。     

CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料.     

缺氧诱导因子调节的靶基因在宫颈癌组织中的表达

目的：探讨缺氧诱导因子在宫颈癌发生发展过程中的作用。方法：应用免疫组织化学SP染色法观察正常宫颈28例、宫颈上皮内瘤样变（CIN）32例、浸润性宫颈鳞癌98例中缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达。结果：HIF-1a在正常宫颈、宫颈上皮不典型增生和浸润性宫颈癌组织中的表达分别为10.71%、37.50%、76.53%;VEGF的表达分别14.29%、46.88%、70.41%;P-gp的表达分别为21.43%、37.50%、54.08%。HIF-1a和VEGF随着宫颈病变的发展表达逐渐升高（从正常宫颈到宫颈上皮非典型增生再到浸润性宫颈鳞状上皮癌）,且各组间差异有显著性（P〈0.05）;P-gp的表达也逐渐升高,其在正常宫颈上皮的表达与浸润性宫颈癌组织中的表达差异有显著性（P〈0.05）,但其在正常组和CIN组以及CIN组和浸润性宫颈癌组中的表达差异较小,无显著性意义（P〉0.05）。相关分析表明,VEGF的表达与HIF-1a的表达显著相关（r=0.585,P〈0.01）,而P-gp的表达与HIF-1a的表达无相关性（P〉0.05）。结论：HIF-1a在宫颈癌组织中过度表达与宫颈癌的发生发展相关,这可能是通过调控VEGF的表达实现的。     

水稻TRAP-PCR反应体系优化与P-糖蛋白基因片段的分析

对影响TRAP-PCR反应体系的各参数,包括模板DNA、dNTP、Taq DNA聚合酶和引物浓度进行了优化,建立了适合水稻的稳定,可重复的TRAP-PCR反应体系.在20μL PCR反应体系中,含80 ng模板DNA,0.25 mmol/L dNTP,0.75 U Taq DNA聚合酶,5 ng/μL随机引物和7.5 ng/μL特异引物.本研究对P-糖蛋白基因片段进行了克隆并序列分析,为深一步研究奠定了基础.     

牛妊娠相关糖蛋白6快速检测试纸条的制备及应用

奶牛妊娠的早期诊断至关重要，妊娠相关糖蛋白6(PAG6)是母体胎盘组织分泌至外周循环中的特异蛋白质，因此，本研究致力于制备牛妊娠相关糖蛋白6快速检测试纸条。制备牛妊娠相关糖蛋白6多克隆抗体，将其稀释后加样至NC膜上，通过固定和封闭制备出一种可检测boPAG6的快速检测试纸条，在试纸条上加入待检血清进行孵育后洗涤，再加入二抗孵育后洗涤，最后加入显色液显色后进行快速检测。标准化快速检测试纸条是将抗体用PBS稀释成10μg/mL点样至NC膜上，在37℃温箱中固定抗体30 min，经5%的脱脂奶粉封闭后制成。待检血清滴加至试纸条后，在37℃温箱中孵育1 h后，进行洗涤和二抗孵育，最后在DAB显色试剂盒作用下显色3 min即可判定。临床检测的初步应用表明，在未孕与怀孕奶牛的混合血清中仍然可以判定是否怀孕，快速检测试纸条特异性强；血清在稀释3200倍的最低检测限时，快速检测试纸条的敏感性良好；而且该结果与ELISA的符合率在80%之上。试验重复性良好，并能在4℃和-20℃条件下保存2周。建立了一种奶牛早期妊娠诊断的快速检测试纸条并应用于初步的妊娠诊断。     

3种细胞穿透肽对体外转录mRNA的递送效果

为了开发合适的mRNA递送载体，本试验采用体外转录、加帽、加尾修饰及氯化锂(LiCl)纯化的方法获得具有生物活性的绿色荧光蛋白mRNA(mRNA-EGFP),然后用合成的3种细胞穿透肽(RVG、RVG9dR、RVG11dR)进行递送。先通过凝胶阻滞试验确定mRNA与3种细胞穿透肽的最佳包被质量比例；再在293T细胞水平上测试3种细胞穿透肽的细胞毒性、包被mRNA后对RNase A的耐受性，并通过凝胶阻滞试验和细胞荧光试验来测试3种细胞穿透肽对mRNA的包被和递送效力。细胞毒性试验结果显示，3种细胞穿透肽的半抑制浓度(IC₅₀)分别是95、90μmol/L和81μmol/L;RNase A保护试验结果显示，3种细胞穿透肽均可保护mRNA不被RNase A降解；凝胶阻滞试验和细胞荧光试验结果显示，3种细胞穿透肽均可成功包被mRNA-EGFP,并把mRNA递送到细胞内进行表达，其中RVG11dR对mRNA的递送效果最好。结果表明，在细胞穿透肽RVG的末端添加一定数量的精氨酸可提高其对mRNA的递送效力。