犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。     

犬细小病毒VP2基因的克隆表达与免疫印迹分析

根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增。把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定。将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,再将构建成功的原核表达质粒载体pGEX-4T-2-VP2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、表达。结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与13个VP2基因序列的同源性为98.4%～99.8%。系统进化树分析表明,所克隆的VP2 CSN830611序列同日本株(AB054222)、意大利株(AF306445)的进化途径一致。Western-blotting分析显示,表达产物为90 kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

犬细小病毒巢式PCR诊断方法的建立及应用

[目的]以期建立犬细小病毒巢式PCR诊断方法.[方法]根据基因库已发表的CPV VP2基因序列设计二对巢式引物,以临床上疑似CPV感染的犬粪样品中提取的总DNA作为模板,用巢式PCR方法扩增出CPV VP2基因的目的条带.[结果]扩增出的目的基因与国际标准序列的同源性为99.3;～ 100;.特异性试验发现该引物不能启动犬其它常见病毒基因的扩增.敏感性试验表明该引物能检测到10-9的CPV总RNA量.重复性试验显示该引物具有良好的稳定性.对采集的26份样品进行CPV巢式PCR检测,20份样品为阳性,阳性率为76.9;.[结论]建立的CPV的RT - PCR检测方法可于临床CPV的快速诊断和小规模的分子流行病学调查.     

狂犬病口服疫苗SRV9毒株基因序列的生物信息学分析

为了解狂犬病口服疫苗SRV₉毒株的基因序列与生物学特性的关系,并就其主要抗原位点与国内外现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,明确其作为口服疫苗株的分子基础,本试验通过RT-PCR方法对狂犬病口服疫苗SRV₉毒株的N、P、M、G、L基因分别进行克隆,并分别连接于pMD19-T载体,经酶切、测序鉴定后,用DNAStar软件对全基因序列进行分析,并与11株目前生产用狂犬病疫苗株进行基因序列比对分析和主要抗原位点的比较.狂犬病口服疫苗SRV₉毒株N、P、M、G、L基因序列与其他毒株的序列同源性为81.8%~100.0%,由全基因组进化树可知,SRV₉毒株与所有疫苗株在同一个大的分支内,均属于基因Ⅰ型,其中狂犬病口服疫苗SRV₉毒株与ERA、SAD B19、SAG-2等口服疫苗株的进化距离最近,而与疫苗生产毒株aG、RC-HL 之间的进化距离则较远.狂犬病口服疫苗SRV₉毒株与各疫苗株的糖蛋白不同结构区的氨基酸同源性分析表明,狂犬病口服疫苗SRV₉毒株与SAD B19、SAG-2、ERA口服疫苗株的膜外区、跨膜区和膜内区的同源性最高.狂犬病口服疫苗SRV₉毒株的基因组结构和抗原基因位点特征均与目前生产用口服疫苗株相似,这为今后狂犬病口服疫苗的研制和通过分子生物学技术构建基因重组弱毒疫苗株的研究提供了试验依据.     

新疆牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查

本研究使用牛双芽巴贝斯虫HSP20（exon）-iELISA检测方法,对2006-2008年新疆14个地州市的牛双芽巴贝斯虫病流行病学进行了调查。结果显示：（1）新疆存在着牛双芽巴贝斯虫病,且比牛巴贝斯虫病严重。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为5.40%。2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清25份,感染率为4.70%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清53份,感染率为7.17%;（2）2008年,发病疫区内牛双芽巴贝斯虫感染率高达30%;（3）牛双芽巴贝斯虫感染的地州市由2006年的8个扩大到2008年的13个;（4）新疆牛双芽巴贝斯虫病的感染率逐年上升,疫区面积不断扩大,流行区内感染率激增。这是新疆首次利用血清学方法对全疆范围内牛双芽巴贝斯虫病进行大规模的流行病学调查。     

新疆地区奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定及其对抗菌药的敏感性试验

通过细菌形态学和细菌生化特性,分离和鉴定了新疆地区患子宫内膜炎的21头奶牛子宫分泌物中的病原菌分别为蜡样芽孢杆菌(24.5%)、非溶血性链球菌(18.4%)、大肠杆菌(14.3%)、溶血性链球菌(10.2%)、表皮葡萄球菌(10.2%)、金黄色葡萄球菌(10.2%)、胎儿弯曲菌(10.2%)和不动杆菌等.其中革兰氏阳性菌检出率较高(73.5%).子宫内膜炎病原菌以单一菌株感染为主(47.6%).采用Kirby-Barer法测定了鉴定菌株对13种抗微生物药的体外药物敏感性.链球菌、大肠杆菌和葡萄球菌对氨苄西林不敏感,而对卡那霉素和庆大霉素敏感性较高;大肠杆菌对青霉素和氨苄西林全部耐药(100%),对四环素和多西环素耐药率较高(均为83.3%);溶血性链球菌对青霉素和四环素全部耐药,对链霉素耐药率为80%;相对而言,表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的耐药率较低;氟喹诺酮类对各种分离菌株比较敏感.     

抗鸡IBDV Gt株单克隆抗体制备及抗原表位初步分析

采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒Gt株免疫BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过三次筛选克隆,获得具有分泌抗IBDV抗体的7D_4、5D_2两株杂交瘤细胞系,并对7D_4及5D_2株进行了特异性、稳定性等方面的鉴定。试验表明,两株分泌的抗体能够特异地与IBDV VP2蛋白反应。7D_4株及5D_2株杂交瘤细胞上清ELISA效价分别为1：250、1：50,腹水ELISA效价为6．4×10~6、5×10~3；并运用7D_4、5D_2介导的相加ELISA进行抗原表位的初步定位,这两株单抗针对不同的VP2抗原表位。     

奶牛子宫内膜炎治疗学研究进展

近几年来国内外治疗奶牛子宫内膜炎的主要方法有7种.化学药物治疗法具有疗效好、成本低的特点,但是对细菌容易产生耐药性和药物易在牛奶和肉中残留.中药治疗法具有低残留、低毒和对细菌不易产生耐药性的优点.中西医结合治疗法既能发挥中药的调节治疗作用,又可发挥西药较强的抗菌消炎能力.微生物学治疗方法采用子宫内接种微生物可以调节子宫内环境,抑制相关微生物的生长,但是要预防微生物引起再次感染.用免疫学治疗法和激素治疗法防治该病是比较新的方法.由于该病病情复杂,所以首先要辩证论治,然后制定出合理的治疗方案,才能够获得理想的治疗效果.