狂犬病“靶向性”中和表位DNA疫苗的构建与瞬时表达

采用RT-PCR获得BALB/c小鼠P41基因,并在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461 nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变；然后采用定向克隆方法将狂犬病病毒糖蛋白主要中和抗原表位核苷酸序列替换P41序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应以获得带有Kozak调控序列的P41-N分子,以增加目的基因的表达量,并将该含有Kozak序列的P41-N分子克隆插入到真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定；最后将各中和表位表达载体转染COS-7细胞,Western blotting检测目的基因的瞬时表达.测序分析结果显示,BALB/c小鼠P41基因CDS区为840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank已登录(NM_010545)核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异；定点突变后获得了P41分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明成功构建了携带P41-N分子的真核表达载体；Western blotting证实各P41-N分子均在COS-7细胞获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P41多克隆抗体发生抗原抗体结合反应.结果表明,成功构建了狂犬病病毒主要中和抗原表位的“靶向性”核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础.     

大肠杆菌菌毛抗原K99与耐热肠毒素STⅠ融合基因的克隆与核苷酸序列测定

采用PCR技术，从大肠杆菌K99中扩增出0．54kb的K99菌毛抗原基因，然后将其克隆到pUCm—T载体上，用Bgl Ⅱ鉴定K99插入的方向并测序。选择目的基因片段插入方向正确的重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，通过T4连接酶与同样经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切合成的耐热肠毒素ST Ⅰ核苷酸序列连接，通过PCR方法鉴定分析和核苷酸序列测序分析，证明插入的K99-ST Ⅰ融合基因片段具有正确的核苷酸序列。     

产肠毒素性大肠埃希菌主要毒力因子及疫苗的研究进展

产肠毒素性大肠埃希菌是目前幼畜腹泻的主要致病因素.文章综述了在畜牧业中产肠毒素性大肠埃希菌的主要致病因子黏附素和肠毒素、EatA及其生化特性,并介绍了产肠毒素性大肠埃希菌的传统灭活苗及新型基因工程疫苗的研究进展.     

健全病死猪无害化处理机制刻不容缓

分析了病死猪无害化处理工作存在的问题,提出进一步修订、完善相关法律,才能从根本上解决病死猪无害化处理问题,为进一步健全养殖户病死猪尸体无害化处理工作提供思路。     

一株猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

从送检的一份疑似链球菌病病死猪病料中分离出1株细菌,通过对分离菌株进行细菌的培养特性、生化试验、玻片凝集试验及PCR分型鉴定,确定为2型猪链球菌,动物致病性试验表明,1×10⁸ CFU/mL的剂量可致死小白鼠,对该分离菌株的毒力因子进行PCR检测发现,溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)和溶血素(sly)均为阳性。此菌的分离鉴定为自家灭活菌苗的制备提供了候选菌株。     

可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶（gdh）序列设计特异性引物，建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条（RPA-LFD）检测技术，优化反应温度与反应时间，评价其特异性与灵敏度，同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测。结果显示：猪链球菌RPA-LFD法检测灵敏度可达100拷贝·μL^-1，优于常规PCR方法，且不与其他常见病原菌发生交叉反应。扩增反应可在较宽温度范围（30~45℃）内高效进行，20~30 min可完成检测。利用临床45例疑似猪链球菌感染样本对检测体系进行评估，其检出率高于细菌分离与常规PCR方法，具有较强的实用性。本研究建立的猪链球菌RPA-LFD检测方法具有强特异性、高灵敏度、易于操作的特点，同时不依赖于仪器、专业操作人员，适用于野外及现场检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体双重荧光PCR检测方法的建立

为了建立快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重荧光PCR检测方法，本试验根据NCBI数据库中的PRRSV ORF7和Mhp P36基因，分别设计引物和TaqMan探针，通过优化扩增反应条件，建立PRRSV和Mhp的双重荧光PCR检测方法；分析所建立PCR方法的特异性、敏感性和重复性，并初步应用于临床样品检测。结果显示，25μL PCR反应体系中各引物最佳添加量：PRRSV-F 1.5μL、PRRSV-R 1.0μL、PRRSV-P 0.8μL、Mhp-F 1.2μL、Mhp-R 1.3μL、Mhp-P 0.7μL。优化后的PCR反应程序：50℃反转录20 min, 95℃预变性2 min, 95℃变性5 s, 55℃退火10 s, 72℃延伸20 s (此处收集荧光),40个循环。建立的双重荧光PCR方法特异性较好，与其他猪常见病原体无交叉反应；检测PRRSV和Mhp的敏感性分别为4.2拷贝/μL和9.6拷贝/μL;批内和批间变异系数均不高于2%,具有很好的重复性。因此，本试验建立的双重荧光PCR方法可同时检测PRRSV和Mhp,为猪繁殖与呼吸综合征...