兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断，建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的TaqMan实时PCR。结果显示，稀释度为1×10⁸～1×10⁴ copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系，决定系数r²为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性，与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应；检测灵敏度为100～1 000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%～1.61%之间。用该方法对60份...     

兔源多杀性巴氏杆菌的发酵培养条件

巴氏杆菌是引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体,主要使动物发生出血性败血症或传染性肺炎。该病原可以在同种或不同种动物间传染[1]。目前,对该病的预防多采用疫苗注射法,但在疫苗免疫过程中普遍存在保护率不高的问题[2]。在疫苗生产中多用液体培养基制备巴氏杆菌抗原,很难实现高密度、高产率、高浓度和高质量生产。禽多杀性巴氏杆菌菌苗抗原的培养工艺主要有固体表面培养法、液体通气培养法、液体浅导静置培养法和液体高密度发酵法,中国《兽用生物制品制造与检验规程》中规定的培养工艺主要是固体表面培养法和液体通气培养法[3]。沈志强等研究…     

几种提纯RHDV方法的比较研究

运用离子交换层析法、凝胶过滤层析法和密度梯度离心法对已作初步处理的RHDV分别进行提纯，并通过血凝性鉴定、抗原蛋白含量检测、ELISA和SDS-PAGE凝胶电泳等方法检测其纯度。结果表明，通过sephadex-200凝胶过滤层析法所提纯病毒的血凝性和蛋白浓度最高；稀释至相同的蛋白浓度之后，该法所提纯的病毒ELISA检测的OD值最大；SDS-PAGE电泳条带1条，经免疫转印分析证明，该条带为RHDV蛋白特异性条带。表明通过该法提纯的病毒，回收率最高、蛋白最纯。     

免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响

通过攻毒试验比较了新西兰家兔免疫前后0、1、2、3和4 log25种抗体水平对病毒性出血症(RHD)的保护效果,同时测定了30、35、40、45、50、55和60日龄非免疫兔的母源抗体效价和用RHD组织灭活苗免疫后8周内血清抗体效价的动态变化。结果表明,抗体效价高于3 log2时可产生100%的保护,2 log2的保护率仅为50%;母源抗体与日龄呈负相关,在30日龄时最高,可以产生有效的保护,在40日龄后已无保护作用;免疫日龄与抗体峰值和有效保护时间呈正相关,30日龄免疫,抗体效价不但不升,反而显著下降,无保护作用;35日龄免疫,抗体峰值较低,有效保护时间仅为2周;大于40日龄免疫,抗体峰值较高,有效保护时间延长。因此建议35日龄首免、2周后二免为最佳免疫程序。     

兔补体C3d基因cDNA的克隆、鉴定及原核表达

以免肝脏组织中提取的总RNA为模板,通过巢式RT-PCR扩增出C3d cDNA,克隆测序后将其连接至表达载体pET-32a,转化入E.coli BL21,用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以包涵体形式存在并得到高效表达；Western blot进一步证实,表达的蛋白为C3d.本研究为开发利用兔C3d奠定了基础.     

兔出血症病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建、表达及其免疫原性

通过RT-PCR方法扩增上海地区兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白基因(VP60).将其克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒质粒,用脂质体法转染HEK293细胞,得到重组病毒pAd-VP60,经RT-PCR、IFA、HA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,结果表明重组VP60蛋白在HEK293细胞中获得表达.表达产物与铝胶佐剂混合后注射3月龄非免疫健康家兔,结果表明,免疫后21 d兔体内产生抗RHDV抗体,其HI效价可达2~6～2~7,能抵御HA≥2~(10)致死剂量RHDV强毒的攻击,保护率为100%.     

集约化兔场腹泻病的发生与防治

集约化兔场腹泻病的发生与防治徐为中薛家宾王启明（江苏省农科院畜牧兽医研究所，南京２１００１４）某兔场从１９９６年８月初到１２月底，有２５１只家兔发生了腹泻，其中死亡１７８只。病兔临床表现为：精神萎顿，拱背坐于笼子的一侧，体温下降，部分患兔消瘦、被毛粗...     

兔病毒性出血症与多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的试制和效果

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗于江苏省农业科学院兽医研究所畜禽生物制品研究开发中心试制5批，计100余万头份。疫苗效力试验对兔病毒性出血症总保护率为100％；对兔多杀性巴氏杆菌病总保护率为95％。疫苗于苏、鲁、皖、浙、沪、晋、闽、津等省、市养兔单位应用，据反馈信息表明，疫苗安全、有效。确认本疫苗的生产工艺成熟、可行，可进行工厂化生产。所生产的二联苗能有效预防该两病的发生。     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要:按照GenBank上公布的兔出血症病毒（RHDV）基因序列设计一对引物，以RHDV发病兔的新鲜肝为材料，提取总RNA，进行cDNA的合成和PCR扩增，结果能扩增出与预期的269bp大小一致的片段，该产物序列与公布的RHDV基因序列有95.8%～98.5%的同源性，表明已成功建立了RHDV RT-PCR检测方法。用该方法和血凝实验（HA）对兔出血症发病兔各组织脏器进行检测，结果表明，发病死亡兔各脏器中，HA检测阳性的病料为肝脏、肾脏、脾脏、血液、肺；RT-PCR检测除粪便外，其它均为阳性，其敏感性是HA的4×104倍。RT-PCR方法检测RHDV敏感度高、特异性强、重复性好，不仅可用于RHD临床诊断和流行病学调查，而且在兔肉等兔类产品的检疫方面具有很好的应用前景。     

兔源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

从送检病死兔肺和肝中分离培养出5株细菌,经过细菌培养、染色镜检、生化试验、PCR鉴定和动物致病性试验对其进行鉴定.鉴定结果表明,分离到的菌株为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,对小鼠有较强的致病性.药敏试验结果表明,分离菌株对环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、恩诺沙星和磺胺六甲氧嘧啶等药物敏感.