大肠杆菌外排泵系统基因表达及ELISA检测方法建立

 【目的】对大肠杆菌AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因进行原核表达,获得的表达产物AcrA、AcrB蛋白分别免疫兔,制备相应的抗体,建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【方法】扩增AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因片段,扩增片段分别与原核表达载体 pET-41a(+)连接构建重组质粒,于BL21（DE3）中进行诱导表达。表达产物AcrA、AcrB纯化后分别免疫新西兰大白兔,获得抗AcrA、AcrB抗血清,并用Western blot方法对表达产物进行鉴定分析。纯化的AcrA、AcrB蛋白分别按不同的浓度包被酶标板,与不同稀释倍数的抗血清反应,通过ELISA检测确定最佳抗原包被浓度及抗体稀释度,初步建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【结果】成功克隆和表达了 acrA、acrB基因片段,经 SDS-PAGE检测表明两种表达产物 AcrA、AcrB均以可溶性蛋白形式存在。AcrA、AcrB抗原蛋白最佳包被浓度分别为 1.0μg?ml-1和0.5μg?ml-1,抗AcrA、AcrB血清的最佳稀释度分别为1﹕800和1﹕400。用初步建立的ELISA方法检测8株大肠杆菌多重耐药菌株外排泵表达水平,结果表明分别用两种蛋白作包被抗体检测外排泵表达水平的结果一致。【结论】本研究通过原核表达的方法获得大肠杆菌AcrAB外排泵系统AcrA、AcrB蛋白并制备了相应的抗体,分别用两种抗体包被酶标板,并建立了大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法,对8株多重耐药菌株的检测结果表明该方法可行、可靠。     

16S rRNA甲基化酶rmtB在猪肠道菌中的传播方式分析

为研究16S rRNA甲基化酶rmtB在猪肠道菌中的传播方式,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分别对来源于A、B猪场的48株rmtB阳性大肠埃希氏菌进行基因分型;用膜接合试验研究rmtB基因的水平传播方式;用微量稀释法对rmtB阳性菌及其接合子进行药敏试验。有45株rmtB阳性大肠埃希氏菌(45/48)能进行PFGE分型,可分为28种不同的PFGE基因型。其中来源于A猪场的20株菌可分为12种基因型,来源于B猪场的25株菌可分为16种基因型;46株rmtB阳性菌可以通过接合试验将rmtB基因及其介导的耐药性传递给受体菌E.coliC600和E.coli488 Rifr,接合频率从4.6×10-13~3.0×10-6不等,接合子对卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、西梭米星、萘替米星、庆大霉素6种二脱氧链霉胺类抗生素均高度耐药(MIC≥512μg/mL)。结果表明,rmtB基因位于接合性质粒上,该基因在两猪场的大肠埃希氏菌中既存在克隆传播,又存在水平传播,以水平传播为主。     

低浓度恩诺沙星对离体恒化器模型中人体肠道菌群的影响

 【目的】应用离体恒化器模型评价低浓度恩诺沙星对人体肠道菌群的影响,为制定微生物学日允许摄入量（ADI）提供依据。【方法】四套接种人体肠道菌群的离体恒化器模型中连续添加0、0.2、2及20 mg•L-1恩诺沙星8 d,采用细菌培养计数和PCR-DGGE方法研究细菌数量、耐药性、菌群结构和定植抗力的变化。【结果】2及20 mg•L-1恩诺沙星可抑制肠道总厌氧菌、总需氧菌和兼性厌氧菌、大肠杆菌、肠球菌的生长（P＜0.05或P＜0.01）;0.2、2及20 mg•L-1恩诺沙星均使总需氧和兼性厌氧菌、大肠杆菌耐药百分率增加（P＜0.05或P＜0.01）, 停药7 d后,总需氧和兼性厌氧菌、大肠杆菌耐药百分率呈下降趋势,但与对照组相比仍处于较高水平（P＜0.01）。20 mg•L-1恩诺沙星对肠道菌群结构的影响较大,使PCR-DGGE图谱发生明显变化,条带数、菌群多态性和相似性参数降低（P＜0.05或P＜0.01）;2和20 mg•L-1恩诺沙星可使肠道菌群对外源沙门氏菌的定植抗力明显下降。【结论】0.2 mg•L-1恩诺沙星（相当于3.67μg•kg-1体重）可对离体恒化器模型中的人体肠道菌群耐药性产生显著影响,说明中国现行规定的恩诺沙星和环丙沙星的ADI（6.2μg•kg-1体重）可能会对人体肠道菌群产生影响,主要为选择出耐药需氧和兼性厌氧菌。     

临床分离鸡毒支原体结构蛋白比较及抗原性分析

应用SDS-PAGE对分离自广东、四川和北京等地区鸡毒支原体及抗生素压力下诱导的耐药鸡毒支原体进行了结构蛋白比较分析.结果显示不同地区分离的鸡毒支原体结构蛋白存在差异,而共同之处是在75KD、55KD、29KD和26KD处都出现了高表达的蛋白条带,与诱导耐药株结果一致.用自制的2株特异性兔抗MG多克隆抗血清对鸡毒支原体临床分离株及实验室诱导的耐药鸡毒支原体进行Western-Blot分析,印迹结果显示所有临床分离鸡毒支原体在分子量大小约75KD和55KD均出现特异条带.     

国内外兽药研发的动向与未来的思考

<正>改革开放以来,我国兽药从无到有,从小到大得到了前所未有的发展,为保障我国畜牧和水产养殖业三十年来的持续增长,为提高和改善我国人民的生活质量和身     

rmtB阳性猪大肠埃希氏菌中氨基糖苷钝化酶分析

分析rmtB阳性猪大肠埃希氏菌中氨基糖苷钝化酶的流行特点。设计10对引物,采用PCR、RFLP和测序等方法检测分析rmtB阳性猪大肠埃希氏菌中的10种氨基糖苷钝化酶基因。采用微量稀释法测定rmtB阳性猪大肠埃希氏菌及其接合子对10种氨基糖苷类的敏感性。48株rmtB阳性猪大肠埃希氏菌中检测到7种氨基糖苷类钝化酶基因,检出率从高到低依次是aac(3)-II(85.8%)、aph(3′)-VII(77.6%)、aph(3′)-II(77.6%)、aadA1(34.7%)、aac(6′)-Ib(14.3%)、aac(3)-IV(10.2%)和aph(4)-I(8.2%);48株rmtB阳性猪大肠埃希氏菌对卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、西索米星、萘替米星、新霉素、链霉素、大观霉素及安普霉素的耐药率分别为100%、100%、100%、100%、100%、100%、79.2%、77.1%、89.6%和27.1%。其对氨基糖苷类抗菌药的耐药表型与钝化酶基因型的符合率最高约98%。研究结果表明,氨基糖苷钝化酶广泛存在于rmtB阳性猪大肠埃希氏菌中,它们与其他氨基糖苷类耐药机制共同介导受试菌对氨基糖苷类抗菌药的耐药性。     

动物源耐药菌对公共卫生潜在影响的风险分析方法解读

由OIE聘任的专家组已建立了一套客观、明确和科学的风险分析程序,可为抗菌药耐药性的风险评估决策提供可靠的依据。对风险评估(定性、定量和半定量)及风险分析各个组成部分作了明确的定义。专家组对抗菌药耐药性的风险评估提出如下建议:在科学数据基础上进行独立的风险评估;多层次的风险分析程序;在考虑定量分析方法之前先进行系统的定性风险评估;建立风险评估政策;给发展中国家提供技术支持。本文对上述方法参考有关文献进行了阐释,可供抗菌药耐药性风险评估参考。     

恩诺沙星对隆腺蚤(Daphnia Carinata)的急性活动抑制毒性测定

恩诺沙星是在畜禽养殖业中得到广泛应用的抗菌药物。以隆腺蚤(DaphniaCarinata)为试验对象,测定了恩诺沙星对隆腺蚤的急性毒性。结果表明,25℃时,24h恩诺沙星对隆腺蚤的最大不致死浓度为1μg·mL-1,使隆腺蚤全部死亡的最低浓度为120μg·mL-1;恩诺沙星在24h、48h时对隆腺蚤的EC50分别为34.03μg·mL-1和19.37μg·mL-1。48h时,恩诺沙星对隆腺蚤的LC50为25.86μg·mL-1。依据蚤类急性活动抑制毒性分级标准,恩诺沙星对于隆腺蚤属于中毒性化合物。     

养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究

【目的】探讨从养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌的gyrA 和parC 基因突变特征。【方法】用琼脂稀释法测定环丙沙星和恩诺沙星对菌株的最小抑菌浓度。PCR扩增gyrA 和parC 基因的喹诺酮耐药决定区，扩增的片段长度分别为525 bp和487 bp，PCR产物直接测序。【结果】在63株突变株中，在GyrA 亚基发生的氨基酸替代有Ser83→Leu（62株）和Asp87→Asn（52株）、Asp87→Tyr（2株）、Asp87→His（2株）；ParC 亚基的氨基酸替代有Ser80→Ile（47株）、Ser80→Arg（2株）和Glu84→Val（3株）、Glu84→Lys（4株）、Glu84→Gly（5株）、Glu84→Ala（1株）。环丙沙星对菌株的MIC小于0.125μg·ml-1时，GyrA和ParC亚基均没有任何变异；环丙沙星的MIC为0.125～0.25 μg·ml-1时，GyrA亚基出现单一氨基酸替代；环丙沙星的MIC为0.5～32μg·ml-1时，出现GyrA 83位和87位双替代或者GyrA83和ParC80位双替代；环丙沙星的MIC为4～128μg·ml-1，发生GyrA 双替代和ParC单替代；环丙沙星的MIC在16～128μg·ml-1，发生GyrA双替代和ParC 双替代。【结论】不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌GyrA和ParC具有多种氨基酸替代类型，而且GyrA和ParC突变位点的数量与菌株对氟喹诺酮类耐药水平呈正相关。     

鸡饲喂洛克沙胂后排泄物中As的形态分析及光降解研究

【目的】探讨洛克沙胂在鸡饲后的排泄规律及对环境生态的毒性.【方法】选用健康黄鸡饲喂含洛克沙胂50mg/kg的全价饲料,连续给药10 d,给药期间及停药后收集不同时间点排泄物样,采用微波消解-原子荧光光度法测定鸡排泄物中总砷和无机As(Ⅴ)、As(Ⅲ)质量分数,高效液相色谱法(HPLC)测定鸡排泄物中洛克沙胂的质量分数.将不同时间点收集的鸡排泄物进行洛克沙胂的光降解试验.【结果和结论】鸡排泄物中砷的排泄量在饲后第108小时质量分数达到稳态(其中洛克沙胂为31.62~35.87 mg/kg,总砷为16.75~21.48 mg/kg),停饲后总砷与洛克沙胂的排泄量呈较快速下降,第120小时时鸡排泄物中已检测不出洛克沙胂,总砷亦降至3.89 mg/kg,此过程中As(Ⅲ)、As(V)含量变化较小,两者最高值分别为0.38和1.81 mg/kg.光降解试验中光照组鸡排泄物中洛克沙胂的降解率为100%,而避光组降解率仅为75.16%,其中无机As(V)、As(Ⅲ)的质量分数均随时间而升高,并以As(V)为主,两者在光照下含量变化速度均比相应避光组快.鸡饲喂洛克沙胂后主要以原形形式排泄,无论在避光或光照条件下鸡排泄物中洛克沙胂均可被降解生成无机砷形态,光照可加速鸡排泄物中洛克沙胂的降解.