禽多杀性巴氏杆菌基因组表达文库的构建及其免疫效果

以限制性内切酶Sau3A I酶切禽多杀性巴氏杆菌基因组DNA,回收500～3 000 bp的DNA片段,连接真核表达裁体pcDNA3.1(+),电转化于大肠杆菌感受态细胞TG1中,构建禽多杀性巴氏杆菌的基因组表达文库.将文库随机分为5个子文库(子文库Ⅰ-子文库Ⅴ),分别提取各子文库重组质粒,以pcDNA3.1(+)和PBS为对照进行动物试验,每组16只BALB/c小鼠,各子文库组和pcDNA3.1(+)组以100 μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μL 1×PBS,各组均免疫3次,每次间隔2周.间接ELISA检测免疫小鼠的血清抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免2周后检测脾淋巴细胞IFN-γ的分泌情况.强毒攻击,计算小鼠的相对保护率.结果显示,动物免疫后子文库Ⅰ组质粒免疫的小鼠血清抗体水平及淋巴细胞增殖水平和IFN-γ分泌水平均持续上升,明显高于其他各组(P＜0.05).动物攻毒试验表明,各子文库组的重组质粒均可为免疫小鼠提供一定的保护,其中第Ⅰ组的保护效果最好,说明子文库Ⅰ组中含有较好的保护性抗原基因,这为进一步筛选相关的免疫原基因和研制新型疫苗奠定了的基础.     

牛分枝杆菌二价组合及融合DNA疫苗的免疫效果

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗.以牛分枝杆菌卡介苗(BCG)为阳性对照,以pCDNA3.1(+)和PBS为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ及IL-2分泌情况.结果显示:融合DNA疫苗组免疫小鼠血清抗体水平、刺激值(SI值)及IFN-γ和IL-2的分泌水平均明显高于其他各组(P<0.05).二价组合DNA疫苗组的体液和细胞免疫指标与BCG组相当(P>0.05),而显著高于两阴性对照组(P<0.05).     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白和脂多糖的免疫保护效果

为确定禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的保护性抗原外膜蛋白(OMPs)和脂多糖(LPS)在抵抗感染中的作用,本研究提取了禽P.multocida CVCC 474的OMPs和LPS成分,将该两种成分分别与弗氏佐剂混合制备免疫原,进行动物免疫。小鼠分为4组:OMPs组、LPS组、禽P.multocida弱毒活疫苗组和PBS对照组,每组16只。各组均免疫3次,每次间隔两周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。以禽P.multocida强毒株CVCC 474进行攻毒,计算小鼠死亡数及保护率。实验结果表明,动物免疫后,OMPs组与LPS组免疫小鼠特异性血清抗体水平持续升高,与弱毒活疫苗组水平相近,与PBS组相比差异极显著(p<0.01)。脾淋巴细胞增殖试验表明,OMPs组、LPS组和弱毒活疫苗组的SI值极显著高于PBS对照组(p<0.01),但3个免疫组之间则无明显差异(p>0.05)。攻毒保护试验结果显示,OMPs免疫组的保护率与弱毒活疫苗相当,为8/10,高于LPS免疫组的保护率(7/10),表明OMPs作为研制禽P.multocida亚单位疫苗具有良好的...     

细菌ghost疫苗的研究进展

用死的病原微生物接种动物能使机体产生抵抗病原体的免疫反应。作为疫苗的制作原则,用死的传染性病原体替代活的病原体已经得到广泛应用。死疫苗易通过化学或物理方法灭活病原菌制得。完整的死菌苗与亚单位疫苗相比有一个优势,即向免疫系统提呈排列复杂的抗原决定簇。     

响应面法优化蛋壳内膜酶解制备抑菌活性物质的工艺条件

本试验以鸡蛋壳内膜为试验材料,用蛋白酶进行酶解,测定酶解液对微生物的抑菌活性,分析碱性预处理、酶解温度、酶解时间、加酶量、酶解pH对鸡蛋壳内膜酶解液抑菌效果的影响,并在单因素试验基础上,利用Design Expert 8.0.6分析软件,采用Box-Behnken中心组合设计法及响应面分析法(RSM)优化酶解工艺条件,得到鸡蛋壳内膜酶解液抑菌效果最佳的酶解工艺条件为:酶解温度45℃,酶解时间2 h,酶用量37.51 U/mg,酶解pH 10.14。该工艺条件下,鸡蛋壳内膜酶解液对S.enteritidis的抑菌圈直径为(17.927±0.19)mm,与理论最优值(17.941±0.21)mm接近,抑菌效果比优化前提高了10.52%,说明拟合方程与实际相符合,所得结果准确可靠。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxⅡCA基因的克隆和基因缺失

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18-ApxIICA,将pMD18-ApxIICA转化到E.coli JM83中并测序.序列分析表明血清型7型25-4株ApxII CA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上.利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18-ApxII△/CA.     

牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达

以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础.     

金色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌单管多重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据金黄色葡萄球菌（Staphylococcus auretls，SA）耐热核酸酶（nut）基因、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi，ST）鞭毛抗原（H1-d）基因和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）热稳定直接溶血素（tdh）基因，分别设计了三对引物Nuc-F／Nu-R、H1-d—F／H1-d—R和Tdh-F／Tdh-R，预计PCR扩增的DNA片断分别为279bp、202bp和458bp。通过对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、退火温度和dNTP浓度等的优化，建立了快速检测金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌的单管多重PCR方法，该方法检测的敏感性分别为：47．8PgST的基因组DNA．22．7PgSA的基因组DNA和0．3745PgVP的基因组DNA。模拟试验显示最低检测限度为分别为：SA150CFU／反应体系，ST98CFU／反应体系，VP53CFU／反应体系。表明该方法具有很好的应用价值和开发前景。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因。采用重叠延伸剪接技术（SOE）获得了融合基因hsp65-esat6，将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a（＋）上，构建重组质粒pET65-E6，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，以IPTG诱导（终浓度为1mmol／L），表达产物进行SDS—PAGE分析。以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western—blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明：Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分，即58ku和30ku，二者相加与预测大小88ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛结核病新型疫苗的研究现状

在过去的20年里,人们应用分子生物学技术来研制更为有效的结核病疫苗,新型候选疫苗大量涌现。这些新型疫苗主要包括减毒活疫苗、重组活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。对防制牛结核病的各种新型疫苗也进行了相应的研究,并取得了令人振奋的进展。各种新型疫苗各有优缺点。目前看来,重组卡介苗和DNA疫苗被认为是最有前途的候选疫苗。但是,所有候选疫苗共同的也是致命的缺点是免疫保护力低。因此,牛结核病疫苗研制的主要努力方向还是在研究分支杆菌免疫机制和免疫失败原因的基础上,进一步增强现有候选疫苗的免疫效力或研制更为有效的新型疫苗。