大黄鱼碱性磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛分布的单脂磷酸水解酶,是动物生物代谢过程中重要的调控酶。实验首次克隆了大黄鱼ALP基因cDNA全序列,命名为LcALP,其全长为2 345 bp,开放阅读框为1 629 bp,编码543个氨基酸。实时荧光定量PCR检测发现,LcALP在大黄鱼雌雄各组织中均有表达,其中在眼和头肾的表达量最高,雌性鳃和脑中LcALP表达量显著高于雄性,而在性腺和脾脏中的表达量则显著低于雄性;胚胎发育过程中,多细胞期、囊胚期和原肠期LcALP基因表达水平相对较低,在卵黄栓形成期明显提高,至孵出期达到峰值,而初孵仔鱼期则显著下调;大黄鱼肌肉细胞系经LPS处理后6 h LcALP表达量降低,12 h显著下调,而poly I:C处理后表达水平持续上升,24 h显著上调至峰值。研究表明,LcALP在大黄鱼胚胎发育调控以及机体免疫防御中发挥重要作用。     

基于dnd基因标记的大黄鱼原始生殖细胞发生发育的初步研究

在鱼类的早期胚胎发育中生殖细胞便与体细胞分离,形成所谓的原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)。母源性基因Dead end(dnd)在胚胎发育中特异地表达于原始生殖细胞,编码一种进化上保守的RNA结合蛋白,对生殖细胞发育具有重要作用。本研究通过PCR获得大黄鱼(Larimichthys crocea)dnd基因(Lcdnd)的部分cDNA序列,结合实时定量PCR、整胚原位杂交等技术,研究Lcdnd在各组织和胚胎发育中的表达。实时定量PCR结果显示：dnd在性腺中特异表达,且其在卵巢中的表达量高于精巢;检测的各期胚胎中都有dnd的表达,随着胚胎的发育其表达量呈下降的趋势。整胚原位杂交结果显示：Lcdnd在早期卵裂阶段主要分布于分裂沟,到囊胚期至原肠早期则开始定位于细胞内,原肠早期时定位在胚环中的中内胚层,且阳性信号增多,暗示此时原始生殖细胞的形成。接着原始生殖细胞沿胚环向胚体形成处(胚盾)迁移;随着胚胎的发育,发现胚体两侧的阳性信号增多;到体节发生期,阳性信号细胞分布于胚体两侧的侧板中胚层,随着体节的发生这些细胞沿背腹轴向腹部运动;发育到孵出期时,到达了发育中的原始生殖嵴。本研究首次使用dnd作为一种较为可靠的大黄鱼生殖细胞标记,揭示了大黄鱼原始细胞的起源与迁移,为大黄鱼生殖细胞发生发育及养殖大黄鱼的育性控制的研究奠定了一定的基础。     

饲料镉对罗非鱼的急性毒性及其安全限量的研究

为研究饲料镉对罗非鱼的急性毒性及其在饲料中的安全限量,将180尾罗非鱼随机分为6组,投喂镉含量分别为0、0.10％、0.25％、0.50％、1.00％和2.00％的饲料,每组3个重复,每重复10尾鱼.记录96 h鱼的病死率及中毒症状,并计算96 h半致死量(LD50)和安全限量.结果表明:罗非鱼饲料镉急性中毒症状与水环境中重金属致鱼中毒症状类似;饲料镉对罗非鱼的96h LD50为(49.67±6.11) mg/kg体质量(BW),安全限量为0.47 mg/kg.     

饲料脂肪水平对黄姑鱼幼鱼生长性能、肌肉组成和血浆生化指标的影响

本研究以鱼油为主要脂肪源,配制脂肪水平分别为4.07%(L4组)、7.04%(L7组)、10.05%(L10组)和12.97%(L13组)的4种等氮配合饲料,并将1 200尾初始平均体重为(41.7±3.1)g的黄姑鱼幼鱼分成4组,进行为期8周的饲养试验,探讨饲料脂肪水平对黄姑鱼幼鱼生长性能、肌肉组成和血浆生化指标的影响。每组设3个重复,每个重复放养100尾鱼。结果表明:L4和L7组黄姑鱼幼鱼的终末均重、终末均体长、增重率、成活率、饲料效率、蛋白质效率、肥满度和脏体比均显著高于L10和L13组(P0.05);L7组黄姑鱼幼鱼的特定生长率和肝体比显著高于L10和L13组(P0.05),但L7和L4组之间差异不显著(P0.05);L4、L7和L10组黄姑鱼幼鱼的肌肉粗蛋白质含量显著高于L13组(P0.05),L4、L7和L10组之间差异不显著(P0.05);L4组黄姑鱼幼鱼的肌肉粗脂肪含量显著低于L7、L10和L13组(P0.05),L7、L10和L13组之间差异不显著(P0.05);L7组黄姑鱼幼鱼的肌肉粗灰分含量显著低于L4、L10和L13组(P0.05),L4、L10和L13组之间差异不显著(P0.05);L4和L7组黄姑鱼幼鱼的血浆中总蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量显著高于L10和L13组(P0.05),而葡萄糖和胆固醇含量以及乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性则显著低于L10和L13组(P0.05)。综合以上试验结果,在本试验条件下,黄姑鱼幼鱼饲料中适宜的脂肪水平为7.04%。     

日本囊对虾组织蛋白酶B基因的原核表达及纯化

采用原核表达的方法得到日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)组织蛋白酶B基因的重组蛋白。以日本囊对虾卵巢组织为试验材料,采用双标签(GST和His)的方法,用带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点以及6×His-tag的特异引物扩增Cathepsin B的开放阅读框,并连接至表达质粒pGEX-4T-2中。将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21中,在30℃条件下,用终浓度为1mmol/L的IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导5h得到最佳诱导量,His亲和柱进行纯化,纯化蛋白依次于8、6、4、2、1、0 mol/L尿素缓冲液中梯度透析,得到复性后可溶于水的重组蛋白,经SDS-PAGE检测,得到单一条带,其分子质量约为63ku。取冻干后的蛋白制备多克隆抗体,抗体效价达50 000,经Western blot检测,同样可在63ku处得到该条带,表明制备的组织蛋白酶B(CB)多克隆抗体具有特异性,该抗体可特异识别CB蛋白。     

大黄鱼性别特异SNP标记的开发与验证

大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类,其雌鱼生长显著快于雄鱼,但两性的外部形态差异不明显,也没有异形性染色体,依靠传统方法无法对其活体准确进行生理性别和遗传性别的判别与鉴定,需要开发性别特异的分子标记。本研究从2尾雌鱼和2尾雄鱼、以及分别由50雌鱼与50尾雄鱼组成的2个混合样品的基因组重测序数据比较中筛选与性别显著关联的SNP位点,对其中11个位点分别设计引物在15尾雌鱼和15尾雄鱼中扩增出PCR产物进行Sanger测序验证,鉴定出1个与性别完全连锁的位点(SNP6,15尾雌鱼均为纯合、15尾雄鱼均为杂合)。然后,设计等位基因特异性PCR引物,其中包括2条雌性与雄性通用引物和1条雄性特异引物,在闽—粤东族与岱衢族大黄鱼合计近2 200个个体中进行扩增,结果在全部雌鱼中都只扩增出1个348 bp的条带,而在全部雄鱼中还扩增出1个194 bp的Y染色体特异条带,检出率达到100%。研究表明,大黄鱼属于XX♀-XY♂类型的性别决定。本研究鉴定出一个雄性特异SNP标记,并建立了一种新的大黄鱼遗传性别鉴定技术,为大黄鱼单性育种、基因组选择育种和性别决定分子机制研究提供了重要的技术手段。     

杂色鲍一种编码CRAD功能域基因的克隆及其在发育和应激中的表达

为探讨Caspase募集功能域(CRAD)在鲍发育和应激中的作用,实验通过比对杂色鲍转录组序列和RACE扩增的方法,获得了杂色鲍一条含CRAD的基因全长c DNA,命名为Hd CRAD;采用实时定量PCR的方法获得了该基因在发育和应激中的表达谱。结果显示,Hd CRAD的c DNA全长1 371 bp,开放阅读框735 bp,编码244个氨基酸。编码蛋白具有保守的CRAD功能域。该基因在各检测组织中均可表达,在黏液腺中表达量最高;在发育各阶段也均有表达,面盘幼虫晚期表达量最高。在细菌感染、高温或缺氧应激处理后,血细胞的Hd CRAD表达水平均有显著性变化。在担轮幼虫时期,RNA干扰该基因会显著提高幼虫畸形率;幼虫的caspase-8和DAD1的表达水平会显著上升,而caspase-3的表达水平会下降。研究表明,该基因参与了鲍幼虫发育过程;在成体免疫、耐高温和抗低氧中发挥了一定作用。     

叶黄素和虾青素对大黄鱼体色及抗氧化能力的影响

为了探讨饲料色素对大黄鱼成鱼体色及其抗氧化能力的影响,在基础饲料中分别添加0 mg/kg(对照组D1)、100 mg/kg(D2)、200 mg/kg(D3)、300 mg/kg(D4)叶黄素和虾青素(1∶1)混合色素配制成4种等氮等能饲料,选择平均体质量为(365.54±5.83)g的大黄鱼1 800尾,随机分为4组,每组设置3个重复,每个重复150尾,进行为期60 d投喂试验。结果表明,投喂30 d后,色素添加组大黄鱼背部和腹部皮肤的黄色值(b*)显著高于对照组(P0.05);实验结束时,除D2组的大黄鱼腹部皮肤的红色值(a*)显著高于其他组(P0.05)外,各组之间大黄鱼背部及腹部皮肤亮度值(L*)和红色值(a*)均无显著性差异(P0.05),各色素添加组的大黄鱼背部和腹部皮肤的黄色值(b*)无显著性差异(P0.05),但均显著高于对照组(P0.05);大黄鱼肝脏总抗氧化能力(TAOC)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均随着色素添加水平的上升而升高,丙二醛(MDA)含量随着色素添加水平的上升而降低。因此,在本试验条件下,饲料中添加叶黄素和虾青素(1∶1)混合色素可以改善大黄鱼成鱼体色及提高其抗氧化能力,综上并考虑饲料成本,建议混合色素添加量为100~200 mg/kg。     

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)病毒性神经坏死病毒的纯化分析及检测方法建立

根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV)RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV。系统进化树分析结果表明XMNNV与RGNNV聚类在一起,与SJNNV、BFNNV和TPNNV等其他鱼类神经坏死病毒亲缘关系较远,说明本研究分离得到的XMNNV属于RGNNV基因型。通过超速离心方法对病毒进行提纯,得到了纯化的NNV病毒。电镜观察结果表明,病毒粒子直径20～25 nm,结构为正二十面体,与已经报道的NNV结构一致。通过对XMNNV与其它RGNNV RNA2基因进行序列比对,在保守区设计引物,运用RT-PCR方法建立了RGNNV的PCR检测方法,该方法灵敏度高达67 copies/μL。纯化的病毒对E11(条纹月鳢细胞系)和大黄鱼肌肉细胞进行感染,结果表明该病毒可以感染这两种鱼类细胞。E11细胞被感染病毒后,细胞出现空泡化,并最终导致细胞分解死亡;大黄鱼肌肉细胞感染后,细胞变圆,慢慢从培养皿壁脱落,最终解体死亡。另外,对感染后细胞进行PCR检测,结果显示为阳性,进一步确定了分离的NNV具有感染这两种细胞的能力。本研究通过电镜观察和PCR检测两种方法确定了患病石斑鱼携带NNV,通过对两种鱼类细胞的感染实验,确定了该病毒具有一定的感染能力。综上,本研究为石斑鱼NNV疾病的诊断提供了有效的方法,对石斑鱼NNV疾病的预防具有一定的指导意义。     

大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性研究

通过设置盐度的突变和渐变实验研究了大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性.结果表明：在盐度突变实验中,将大黄鱼幼鱼直接从海水（盐度27.2）移入盐度为3～24的水中,72 h内不会导致明显死亡;从海水移入盐度为2的水中,72 h的存活率可达72%;从海水移入盐度为1的水中,3 h后开始出现死亡,24 h内大部分死亡;从海水移入淡水中,6 h内全部死亡.在盐度渐变实验中,将大黄鱼幼鱼从海水直接移入盐度为6的水中后,再以不同的幅度降低盐度,在盐度高于3时,大黄鱼幼鱼的死亡率与相应盐度的突变实验相比无明显差异;在盐度低于2时,大黄鱼幼鱼的死亡率低于相应盐度的突变实验的结果.研究表明,大黄鱼幼鱼具有较高的低盐度耐受力.