羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

草菇gpd启动子的克隆及表达载体的构建

从草菇基因组中克隆内源强启动子,为草菇基因工程育种提供启动子元件材料。［方法］采用PCR技术从草菇基因组DNA中克隆gpd启动子片段,利用生物信息学手段对其序列特征和调控元件进行分析,并构建表达载体。［结果］从草菇基因组中克隆出2条特异gpd启动子片段,大小分别为1056和614bp;成功构建了分别以这2条启动子片段驱动的、以gfp基因为报告基因的2个表达载体。［结论］该研究为进一步利用基因工程手段培育品质优良的草菇新菌株奠定了基础。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

[目的]克隆鹅副粘病毒GX1株HN基因与F基因,并进行序列分析。[方法]根据Genbank已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株基因组核苷酸序列设计2对引物,对从广西发病鹅分离到的鹅副粘病毒毒GX1株的HN和F基因进行PCR扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。[结果]该株副粘病毒株的HN基因和F基因核苷酸序列全长分别为1 716和1 662 bp,与GPV-SF02株的同源性均在97.3%左右,与LaSota株、F48E9株、JS株的同源性为80.3%~97.5%,与M iyadera株的同源性仅84.8%。[结论]分离株GX1株与禽Ⅰ型副粘病毒(A PMV-1)强毒株特征相符,属于A PMV-1基因Ⅶ型。     

Molecular characterization and variability analysis of <Emphasis Type="Italic">Apple scar skin viroid</Emphasis> in India

Apple scar skin viroid (ASSVd) infection is a major limitation to apple fruit quality and causes huge economic losses. In surveys of apple orchards in the northern Indian state of Himachal Pradesh, fruits with dappling symptoms were noticed. ASSVd was detected from these fruits and molecularly characterized. Ten clones from three isolates were sequenced, of which seven were new sequence variants of ASSVd. The clones had significant sequence variability (94–100%) with each other. Variability was more common in the pathogenic domain of the viroid genome. Four of the clones were 330 nucleotides (nt) long, and the other six had an additional nucleotide. Phylogenetic analysis showed close affinity of the present isolates with some Chinese and Korean isolates. The study reports seven new variants of ASSVd and also provides the first molecular evidence of viroid infection (ASSVd) in apple in India.     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表达

为了获得高效表达的抗菌肽D2A21,本研究根据抗菌肽D2A21的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成D2A21基因,并将该合成基因克隆至pProEXHTb载体中,构建成含有含6个组氨酸标签的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌中,经摇瓶发酵,IPTG诱导后,发酵液用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明,成功合成D2A21基因,并构建了抗菌肽D2A21表达载体。通过镍柱亲和层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,抗菌肽D2A21能够在大肠杆菌中稳定表达。本研究将为大规模表达纯化D2A21及其进一步的研究和利用提供一定基础。     

琯溪蜜柚CmPME1的克隆及其在果实发育过程中的表达分析

利用RT-PCR技术从‘琯溪蜜柚’中克隆得到1条PME（pectinmethylesterase）基因的ORF序列,命名为CmPME1。该序列编码一个含有582个氨基酸的蛋白质,分子量63.37 ku,该蛋白属于稳定的碱性亲水性蛋白。同源性分析表明：其编码的氨基酸序列与可可树（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）的同源性分别为76％、74％,与甜橙的氨基酸序列同源性高达99％。实时荧光定量PCR结果表明,随着果实的发育,CmPME1的表达量逐渐升高,在花后170 d达到最高,然后逐渐降低,远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱。     

剑麻斑马纹病菌5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析

以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5个基因cDNA序列为参考,设计基因编码区特异性引物。利用5对引物分别对剑麻斑马纹病菌进行分子检测以及基因同源克隆。通过此方法首次从剑麻斑马纹病菌中获得了5个多聚半乳糖醛酸酶基因,并分别命名为Szpg1～Szpg5。检测结果表明,Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被检测剑麻斑马纹病菌中。序列分析结果表明,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5对应基因之间存在核苷酸序列差异,由此导致个别氨基酸的差异,甚至提前终止。由此推测,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5在功能上可能存在着一定的差异。     

杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆杜梨硝酸盐高亲和性转运酶NRT2基因。[方法]以杜梨叶片为试验材料,采用CTAB法提取总RNA,反转录成c DNA,运用3'-RACE和5'-RACE技术,克隆获得杜梨硝酸盐转运酶NRT2基因的全长,并运用生物信息学技术对硝酸盐转运酶NRT2基因进行了分析。[结果]杜梨硝酸盐转运NRT2基因c DNA全长为1 422 bp,可编码473个氨基酸,分子式为C2346H3631N589O637S26,相对分子质量为51 112.7,等电点(p I)为7.03。[结论]该试验为进一步研究梨氮素代谢提供了基础资料。     

蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)为研究材料,利用同源序列法克隆得到1个DREB3类转录因子基因,命名为MwDREB3,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析MwDREB3 基因的表达特征,为蒙古冰草优异抗性基因的挖掘和利用提供理论依据.结果表明:该基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框,长度为774bp,编码257个氨基酸,该蛋白近5'端含有1个保守的AP2结构域.系统进化树分析表明MwDREB3 编码的蛋白与小麦(Triticum aestivum)的DREB、山羊草(Aegilops columnaris)DRF1的进化关系较近.该基因在干旱、高盐、ABA诱导条件下,表达量上调;在低温条件下,表达量下调.