基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。     

大菱鲆心脏细胞系的建立与鉴定

为丰富海水鱼类细胞系的数量,提供更多的基因功能研究及病毒分离、鉴定工具,本研究建立了一种新的细胞系,大菱鲆心脏细胞系(Scophthalmus maximus heart cell line,SMH).该细胞系使用组织块法(tissue block method)启动原代培养,培养液是添加了胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、人类碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、抗生素、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)的DMEM/F 12.结果显示,SMH形态呈典型的成纤维细胞样,在培养液中生长分裂旺盛,经230 d传代培养,成功传至58代.用带有绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)的pEGFP-N3质粒转染SMH,发现GFP在细胞中成功表达,转染效率为40％左右.使用遗传霉素(geneticin,G418)对重组质粒细胞进行筛选,得到了一簇荧光表达效率高的细胞.染色体分析表明,具有正常二倍体核型(2n=44)的细胞占64％.线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase sub-unit Ⅰ,CO Ⅰ)基因鉴定出该细胞系来源于大菱鲆.该细胞系的建立为大菱鲆功能基因及其他基于细胞系的研究奠定了基础,对大菱鲆的病毒感染途径和分子机制研究具有重要的理论意义.     

一株引起坛紫菜绿斑病病原的分离鉴定及致病性研究

为了明确引起坛紫菜绿斑病的病原,对2012年发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿斑病开展了病原的分离鉴定和致病性研究。利用2216E海水培养基平板,从患病藻体分离得到一株优势细菌X5;在实验室条件下将X5进行回接感染实验,在显微镜下观察到坛紫菜叶状体发生组织病理变化,出现绿斑病症状:感染初期出现黄绿色小斑点,病斑逐渐扩大出现空洞,最后导致紫菜叶片流失;用浓度为10⁴~10⁸ cfu/mL的X5感染坛紫菜时,在7 d内引起紫菜出现10%~100%病斑面积,这些结果表明X5为坛紫菜绿斑病的病原。利用生理生化和多基因序列分析方法对X5进行鉴定,结果显示该菌为革兰氏阴性菌,大小为0.6 μm×0.4 μm~1.0 μm×0.4 μm,无鞭毛,在温度4~42℃、盐度50~150、pH6~10范围内生长,最适生长温度为16℃,最适生长盐度为50,最适pH为7,对甲硝唑、林可霉素和青霉素耐药,对25种抗生素敏感,Biolog和API ID-32E细菌鉴定系统的结果显示X5为弧菌属细菌(Vibriosp.);基于多基因序列(16S rRNA,rpoA,recA,pyrH)构建的系统进化树分析显示,X5与V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis聚为一支,进化距离为0.095~0.108,这些结果说明X5为弧菌属的一个新种或是V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis之一的一个新亚种。本研究报道了弧菌X5能够引起坛紫菜绿斑病,为紫菜流行病学及疾病防治提供了理论支撑。     

以优化的BP神经网络模型为基础研究山东近海口虾蛄空间分布与环境因子的关系

BP神经网络模型作为一种常用的机器学习方法,被广泛应用于物种分布模型,以解析生物分布与环境因子的关系。与传统回归模型相比,该模型可以灵活处理变量间的非线性关系,但其结构复杂,在参数设置方面存在不确定性,从而影响模型的预测与应用。根据2016—2017年山东近海口虾蛄渔业资源调查与环境数据,利用BP神经网络模型构建口虾蛄资源分布模型,同时利用数据分组处理算法(group method of data handling, GMDH)、遗传算法(genetic algorithm, GA)和自适应算法(adaptive algorithm)分别对模型输入变量、初始权值和隐节点数目3方面进行优化,构建7种不同组合优化模型。结果显示,7种模型的优化效果存在明显差异,单方面和两方面组合优化模型预测性能基本保持一致;而三方面共同优化其均方根误差与残差平方和分别为0.35和1.94,较初始模型的0.52和2.40更小,且相关系数最大为0.45,表明模型优化效果最好。对比优化前后发现,口虾蛄资源密度随纬度和底层盐度变化趋势基本保持一致,而随底层温度的升高,口虾蛄资源密度存在较大差异。此外,最优模型较初始模型增加水深为关键环境因子,对口虾蛄的资源密度具有重要影响。本研究进一步开发了BP神经网络模型参数优化的方法,证明了参数优化对BP模型的预测性能具有重要影响,模型优化对于分析口虾蛄资源密度与环境因子的关系具有重要意义。     

长蛸脑显微结构及视腺的超微结构

为研究长蛸神经系统结构及神经调控机制,通过解剖学和石蜡组织切片技术对长蛸的脑部结构进行观察。结果显示,以食道为参照,根据所处位置将脑分为3部分:食道上神经团、食道下神经团以及位于食道上下神经团两侧的视叶区。食道上神经团包含垂直叶、上额叶、下额叶、前基底叶和后基底叶,食道下神经团包含腕叶、足叶、巨细胞叶、色素细胞叶、内脏叶、外套内脏叶和血管舒缩叶,视叶区包含视神经、视叶、视腺、嗅叶、脑脚叶和视神经束。采用石蜡组织切片、光镜和透射电镜技术对视腺进行显微和超显微结构观察,结果发现视腺外有一层结缔组织包裹,位于视神经束区上,与嗅叶和脑脚叶相邻;内部可观察到大量分泌细胞,细胞核较大,直径范围为4～8μm;分泌细胞含有丰富的粗面内质网、高尔基体及高尔基体分泌的分泌小泡与大泡。研究表明,长蛸视腺结构特征与曼氏无针乌贼和真蛸的高度相似。     

青石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交后代及其父母本群体的染色体核型分析

为了探究杂交后代与双亲染色体组型的差异, 证明青石斑鱼(Epinephelus awoara)和蓝身大斑石斑鱼 (Epinephelus tukula)杂交在染色体水平上的可行性, 以及建立石斑鱼外周血淋巴细胞培养制备染色体制片技术, 本研究以 4 月龄和 16 月龄青石斑鱼(♀)×蓝身大斑石斑鱼(♂)杂交后代、4 月龄母本后代和父本为实验材料, 通过头肾 -秋水仙素法和外周血细胞培养法制备染色体制片, 经油镜观察和分裂相统计, 结果表明青石斑鱼的染色体数目为 2n=48, 占比 91.00%, 核型公式为 2n=48t, NF=48; 蓝身大斑石斑鱼具两个亚中部着丝粒染色体, 染色体数目为 2n=48, 占比 82%, 核型公式为 2n=2sm+46t, NF=50, 臂比为 1.76±0.11; 杂交后代(E. AT)具一个亚中部着丝粒染色体, 染色体数目为 2n=48, 占比 78%, 核型公式为 2n=1sm+47t, NF=49, 臂比为 1.75±0.29。同时, 本研究对 4 尾 16 月龄杂交后代鱼的性腺进行组织切片, 观察发现所有个体性腺中具有大量卵母细胞, 杂交后代均为雌性, 初步说明杂交后代所具有的异形染色体与性别无关, 推断异形染色体形成的原因是父本提供了 23 条端部着丝粒染色体和 1 条亚中部着丝粒染色体, 母本提供了 24 条端部着丝粒染色体。研究结果为石斑鱼杂交后代异形染色体发生、遗传变异, 以及杂交后代性状选育和种质改良提供了丰富的资料。     

凡纳滨对虾不同品系繁育性状的比较分析

为了评估不同品系凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)雌虾繁殖性能和后代幼体发育情况, 在相同养殖条件下, 选取野生群体雌虾 90 尾, P 品系雌虾 166 尾, S 品系雌虾 115 尾, 构建了 103 个家系。其中, 野生群体家系 56 个, P 家系 28 个, S 家系 19 个。本研究共进行 30 d, 记录了整个生产周期内每尾雌虾的繁殖参数及后代幼体的发育数据。结果显示, 与 P 品系和 S 品系相比, 野生群体雌虾在交配率和孵化率方面具有显著优越性。在雌虾产卵性能方面, P 品系雌虾产卵量极显著低于另外两个品系(P＜0.01), 产卵周期极显著高于另外两种品系(P＜0.01)。关于幼体发育, 无论是在幼体存活率还是变态时长方面, 野生群体都表现出一定的优越性。分析凡纳滨对虾各繁殖性状间相关关系, 发现在 3 个品系中均可以观察到体重与产卵量呈显著正相关(P＜0.05), 野生群体、P 品系和 S 品系体重与产卵量的相关系数分别为 0.364、0.278 和 0.553。凡纳滨对虾的受精卵孵化率与幼体变态(Z_Ⅰ→P₁)发育时长呈显著负相关(P＜0.05), 相关系数为?0.211, 这表明凡纳滨对虾受精卵孵化率越高, 其幼体变态发育时长越短。研究表明, 凡纳滨对虾雌虾不同品系间的繁育性能具有较大选择潜力, 在筛选高繁育性能亲虾品系的过程中可以根据雌虾繁殖力高低及后代幼体发育情况综合进行选择。     

不同捕捞策略对海水青鳉不同发育阶段生长的影响

以海洋模式物种—海水青鳉(Oryzias melastigma)为研究对象, 设置了 90%大个体捕捞(H-B)、90%随机捕捞 (H-R)、75%大个体捕捞(M-B)、75%随机捕捞(M-R)、50%大个体捕捞(L-B)、50%随机捕捞(L-R)、75%小个体捕捞 (M-S) 7 种捕捞策略处理组, 用以研究海水青鳉的生长特征在不同捕捞策略、不同世代(F1、F2 和 F3)之间的差异。 结果表明, 同代际不同捕捞策略条件下, 海水青鳉卵径和仔鱼全长呈极显著性差异(P＜0.01); 不同代际间, 高强度捕捞处理组(90%捕捞策略) 卵径增大, 低强度捕捞处理组(50%捕捞策略)卵径变小, 但不同世代对下一代鱼卵的孵化率和存活率影响较小。不同代际间, 低强度捕捞处理组在幼鱼时期增长率高于其余处理组; 同代际间仔鱼发育阶段, 高强度捕捞处理组生长迅速, 前期增长率明显高于后期, 其在仔幼鱼阶段其增长率低。随着外界捕捞压力的增加, 同代际间高强度捕捞处理组瞬时增长率最低; 低强度大个体捕捞策略组瞬时增长率在代际间较稳定。与现阶段捕捞策略相同, 高强度大个体捕捞会导致鱼类生物学性状在 3 代中产生极大差异。因此本研究通过模拟不同捕捞策略探讨鱼类发生的生物学性状变化, 旨在为预测鱼类进化趋势的深入研究提供依据。     

南极鱼亚目鱼类DNA条形码及分子系统学

以南极海域“南极海洋生物资源养护委员会”(the Commission for the Conservation Antarctic Marine Living Resources, 简称 CCAMLR) 48.1、48.2 和 48.3 亚区的南极磷虾(Euphausia superba)渔业兼捕所得 97 份南极鱼样品为研究对象, 经形态学特征分析和 DNA 条形码将其鉴定为南极鱼亚目 4 科 17 属 17 个有效种, 其中依据形态学特征只鉴定出 6 个物种, 其余 11 个物种则依据 DNA 条形码得到准确鉴定。可见, 在形态学鉴定经验不足或样品形态不完整的情况下, DNA 条形码可以有效的实现物种鉴定。继而, 分析了南极鱼类 97 条 DNA 条形码的碱基组成特征, 发现 GC 含量第一密码子最高且第二密码子最低可能为南极鱼亚目类群的特有现象, 但其生物学意义尚有待于进一步研究。将本研究采集的南极鱼亚目 17 种鱼类与 BOLD 筛选的 64 种鱼类的 DNA 条形码合并, 构建了南极鱼亚目 4 科 39 属 81 种鱼类的系统关系树, 这是迄今为止包含种类最多的南极鱼亚目鱼类分子鉴别和系统进化关系分析。遗传距离和系统关系树分析进一步证明 DNA 条形码对于南极鱼类物种鉴定的适用性与可行性, 另外还发现南极鱼亚目鱼类的个别物种其分子系统关系与形态学分类地位不一致。本研究结果证实了 DNA 条形码技术对南极鱼亚目分类群的识别效率, 弥补了传统形态学鉴定方法的局限和不足, 丰富了南极鱼类 DNA 条形码数据库, 为南大洋鱼类多样性与适应性进化研究奠定基础, 同时为南极渔业资源保护和可持续开发利用提供科学依据。     

不同海拔稻鲤综合种养梯田大型底栖动物群落结构特征

2019 年 5—8 月在云南省红河县哈尼梯田研究了不同海拔(570 m 和 1840 m)稻鲤综合种养梯田中大型底栖动物的群落结构。结果表明: (1)低海拔梯田内共发现大型底栖动物 25 种, 隶属 3 门 3 纲, 其中寡毛纲(Oligochaeta) 9 种, 昆虫纲(Insecta)16 种, 腹足纲(Gastropoda)1 种; 高海拔梯田内共发现大型底栖动物 24 种, 隶属 2 门 2 纲, 其中寡毛纲 3 种, 昆虫纲 21 种。寡毛纲和昆虫纲是高、低海拔梯田的主要大型底栖动物类群, 且种类组成差异显著 (P<0.05)。高、低海拔梯田均发现了摇蚊属(Chironomus)和长跗摇蚊属 (Tanytarsus)水稻害虫, 此外, 在低海拔梯田还发现了水稻害虫福寿螺(Pomacea canaliculata)。(2) 4 个月份 Jorgensen 指数值和 Jaccard 相似性指数值均说明不同海拔梯田中大型底栖动物群落结构存在较大差异。(3) 6 月和 7 月, 高、低海拔之间 Shannon-Wiener 多样性指数、 Pielou 均匀度指数、Margalef 丰富度指数在同一月份差异显著(P<0.05), 其余月份差异不显著(P>0.05)。(4)双因素方差分析表明, 月份和海拔对不同海拔梯田中的大型底栖动物密度影响显著(P<0.05), 月份对生物量影响显著 (P<0.05), 而海拔对其影响不显著(P>0.05), 月份和海拔间均存在交互作用(P<0.05)。研究表明, 月份和海拔是影响不同海拔哈尼梯田稻渔综合种养系统大型底栖动物群落结构的主要因素, 同时, 鲤的摄食压力也是导致大型底栖动物群落结构变化的重要因素, 鲤可以有效降低梯田中水稻害虫的生物量。