拟穴青蟹14-3-3ζ基因cDNA的克隆和表达分析

利用SMART RACE技术克隆得到拟穴青蟹ERK信号通路的酪氨酸3 加单氧酶/色氨酸5 加单氧酶激活蛋白ζ（14-3-3ζ蛋白）基因。其cDNA全长1 092 bp,编码248个氨基酸。实时定量PCR结果显示14-3-3ζ基因在各组织器官均有表达,但在卵巢中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,在卵黄发生中期14-3-3ζ的表达量显著高于增殖期（P<0.05）,推测其在青蟹卵巢中发挥重要作用。     

拟穴青蟹14-3-3ζ基因cDNA的克隆和表达分析

利用SMART RACE技术克隆得到拟穴青蟹ERK信号通路的酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ(14-3-3ζ蛋白)基因.其cDNA全长1 092 bp,编码248个氨基酸.实时定量PCR结果显示14-3-3ζ基因在各组织器官均有表达,但在卵巢中的表达量显著高于其他组织(P＜0.05),在卵黄发生中期14-3-3ζ的表达量显著高于增殖期(P＜0.05),推测其在青蟹卵巢中发挥重要作用.研究亮点:目前尚未有14-3-3蛋白参与甲壳动物卵巢发育的相关研究.本文首次在拟穴青蟹中获得14-3-3ζ基因eDNA全长,发现其在卵巢中的表达量最高,且在卵黄发生中期的表达量显著高于增殖期,推测14-3-3ζ蛋白可能参与青蟹卵巢发育过程信号途径的传导.     

刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶段的mRNA表达

从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段,利用5'RACE和3'RACE技术首次克隆获得其cDNA,全长为1602 bp,包含1356 bp的开放阅读框,编码451个氨基酸,预测蛋白质分子量为49.78 kD。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白,氨基酸序列的第142～148位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG)。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%～95%,且在系统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史阶段的表达进行检测,结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P0.05)。我们进一步构建了α-微管蛋白重组表达载体,并转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白分子量约为50 kD,与预测的结果一致,即成功诱导表达α-微管蛋白。本实验结果为后续制备α-微管蛋白有效亚单位疫苗防治刺激隐核虫病奠定了基础。     

欧洲鳗鲡MyD88基因的克隆及其免疫功能分析

髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,My D88)是TLR(toll-like receptor)信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡My D88基因c DNA全长序列,命名为Aa My D88,其全长为1 539 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的My D88十分相似,具有My D88家族典型的死亡结构域和TIR(toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示,欧洲鳗鲡My D88氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为76.3%,与其他鱼类相似性为67.5%~73.2%,与哺乳动物相似性较低,为61.6%~62.6%。欧洲鳗鲡My D88在系统进化树中与其他鱼类My D88聚为一支,哺乳类以及两栖类My D88分别聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,Aa My D88基因在欧洲鳗鲡各组织器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏、肠、脾脏以及肾脏中也有较高的表达,而肌肉和鳃中的表达水平较低;欧洲鳗鲡经山羊Ig G肌肉注射后,肾脏Aa My D88基因在第7天表达量有显著性提高,14 d后恢复至正常水平,而脾脏Aa My D88基因表达水平从第7~21天持续显著上调,于第7天达到峰值,其表达量为肾脏的1.7倍;欧洲鳗鲡鳍细胞系经poly I:C处理后,Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6~48 h均有显著升高,于12 h达到峰值。LPS处理后的欧洲鳗鲡鳍细胞系Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6和12 h显著升高,于12 h达到峰值,24 h后恢复至正常水平。poly I:C处理组My D88基因表达水平在12~48 h均显著高于LPS处理组。研究表明,My D88在欧洲鳗鲡抵御外源微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

杂色鲍DAD1的克隆及在发育、弧菌感染、高温和缺氧下的表达分析

抗细胞凋亡因子(DAD1)是细胞凋亡的负调控因子。在杂色鲍转录组测序的基础上,通过RACE的方法,获得了杂色鲍DAD1基因的全长c DNA,命名为HdDAD1。该序列全长553 bp,开放阅读框339 bp,编码112个氨基酸。编码蛋白具有保守的DAD功能域和3段跨膜区。实时定量PCR结果表明,HdDAD1在杂色鲍所检测组织中均有表达,消化道、鳃、血细胞、粘液腺和肾脏中表达量最高。同样,HdDAD1在发育各阶段均有表达,幼虫阶段表达量最高,原肠胚次之,其他胚胎发育阶段和稚鲍表达量最低。HdDAD1能够响应细菌感染、高温和缺氧应激。在弧菌注射12 h后,表达量显著上升。当水温由最适的25°C上升到28°C时,HdDAD1表达量升高;在31°C持续4和96 h时HdDAD1表达量显著上升。在低氧处理4和96 h时,HdDAD1的表达量也显著上升。     

拟穴青蟹miR-34靶基因预测及其生物信息学分析

MiR-34是一类在进化过程中高度保守的miRNA家族,参与机体的许多重要生命活动。本研究首先比较本实验室构建的拟穴青蟹miRNA数据库中的miR-34(spa-miR-34)和通过miRBase获得的多个物种的miR-34的序列特征,然后应用RNAhybrid和Segal Lab两种在线工具预测spa-miR-34的靶基因,用blast2go软件对这些靶基因进行功能注释和信号通路富集分析。结果表明,spa-miR-34可能的靶基因有66个,这些基因的功能主要包括氧化还原、磷酸化、钙离子跨膜运输、转录等生物学过程;信号通路主要富集于精氨酸和脯氨酸代谢、抗生素生物合成、苯丙素生物合成、糖酵解和糖异生等合成代谢通路中。spa-miR-34预测的靶基因所涉及的基因家族和通路亦包括CHH家族、ERK通路、细胞周期和UPP通路、SUMO通路。此外,spa-miR-34预测的靶基因还有蜕皮激素受体,推测spa-miR-34在生殖、蜕皮及氨基酸等物质代谢方面具有重要作用。本研究为进一步了解spa-miR-34在拟穴青蟹中的作用提供了重要参考资料。     

大黄鱼肿瘤坏死因子受体基因(TNFR)的克隆及其在各组织和副溶血弧菌感染下的表达

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)与肿瘤坏死因子受体(TNF receptor,TNFR)超家族在机体的先天免疫和获得性免疫方面都发挥重要作用。本研究从本实验室构建的大黄鱼(Larimichthys crocea)EST(expressed sequence tag)数据库中筛选出TNFR(LcTNFR)基因片段,利用SMART-RACE技术克隆出大黄鱼LcTNFR基因cDNA全序列,全长2 016 bp,其中5'非翻译区(untranslated region,UTR)64 bp,3'非翻译区602 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 350 bp。ORF编码449个氨基酸(GenBank登录号:KF432416)。预测的蛋白质等电点为5.47,分子量为49.7 kD。对LcTNFR蛋白三维结构进行分析发现,其含有6个α螺旋,不含β折叠。Blast比对分析显示,与斑马宫丽鱼(May landia zebra)的TNFR 10B-like氨基酸序列一致性最高,达74%;与斑马鱼(Danio rerio)卵巢型TNFR一致性较高,达51%;与鲫鱼(Carassius auratus)TNFRⅠ的一致性为47%。鱼类TNFR进化树分析进一步表明,LcTNFR与TNFR 10B-like、TNFRⅠ及卵巢型TNFR聚为一大支。荧光定量PCR结果显示,TNFR基因在大黄鱼各组织中均有表达,在卵巢的表达水平最高,显著高于精巢及其它组织;其次在免疫相关组织脾脏也有较高的表达。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后的第2天和第4天,LcTNFR基因在大黄鱼脾脏组织中的表达量达到最高,显著高于对照组(P0.05),到第8天逐渐回落到对照组水平。本结果可为大黄鱼免疫学研究及抗病相关分子标记的开发提供参考依据。     

日本囊对虾性腺蛋白质双向电泳的样品制备方法的改进

采用一种能同时提取RNA、DNA和Protein的试剂（RDP试剂）进行日本囊对虾性腺总蛋白质的制备，并通过双向电泳（2-DE）技术与传统的裂解液法比较提取效果．RDP法所得2-DE图谱清晰，条纹少，蛋白质点数多，而裂解液法存在横向和纵向拖尾，其碱性端蛋白质点大量缺失，说明RDP法能有效去除蛋白质样品中盐离子、脂类等干扰成分．结果不仅为后续的日本囊对虾性腺蛋白质组学研究提供了技术保障，也为其他甲壳类动物性腺总蛋白质的提取提供了借鉴．     

拟穴青蟹泛素基因的克隆及其在性腺发育过程中的表达

在实验室所构建的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)EST文库基础上筛选出泛素基因(Ubquitin,Sp-Ub)片段,利用RACE技术克隆其全长cDNA序列,并对其结构进行分析;利用实时定量PCR技术检测该基因在雌蟹各组织及性腺不同发育阶段中的表达情况。结果显示,Sp-Ub基因全长555 bp,编码154个氨基酸,其第1~76个氨基酸为高度保守的泛素结构域,第101~147的氨基酸残基为典型的核糖体蛋白S27a的保守区域;预测的泛素结构域二级结构由5个延伸链,1个α-螺旋及其连接的无规卷曲构成,Sp Ub三维结构由1个α-螺旋以及5个β片层。多重比对表明不同物种的泛素结构域和核糖体蛋白S27a结构域在进化过程中高度保守。定量PCR结果显示,Sp-Ub在鳃中的表达水平最高,卵巢次之,各组织间的表达无显著性差异,说明Sp-Ub基因在各组织中的表达恒定,且具有普遍作用;在卵巢发育过程中,Sp-Ub在O5期的表达水平最高,O1、O4期次之,O2期表达量最低且与O5期具有显著差异(P<0.05);在精巢发育过程中,Sp-Ub在T2期的表达量最高,其次为T1期,T3期表达最低且与T2期具有显著差异(P<0.05)。本研究结果说明了Sp-Ub对拟穴青蟹生殖细胞的生长和发育可能具有重要作用。本研究将为甲壳动物性腺发育调控的分子机制奠定基础。     

杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶基因克隆及应激下的表达

 利用本实验室获得的杂色鲍(Haliotis diversicolor)转录组测序数据库, 筛选出杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶(Purple acid phosphatase, PAP)同源片段, 进而克隆获得PAP的cDNA全序列, 命名为HdPAP, 并进行了HdPAP蛋白的结构分析和功能预测, 同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析HdPAP基因的组织表达谱和应激条件下的HdPAP表达变化。HdPAP基因cDNA全长1 215 bp, 含有1个编码322 个氨基酸的969 bp的开放阅读框。经Blast比对, 与无脊椎动物半索动物门囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的PAP氨基酸序列一致性最高, 达59%。通过实时定量PCR检测, HdPAP在检测的杂色鲍各组织中均有表达, 其中在血细胞和肝胰腺的表达量显著高于其他各组织(P<0.05)。高温应激下, 在检测的6个时相中, HdPAP在血细胞、肝胰腺和鳃中均出现不同程度的表达抑制。缺氧应激后, 4 h血细胞中HdPAP显著低于对照组, 24 h恢复到正常水平, 96 h显著高于对照组(P<0.05), 到192 h又恢复到正常水平。副溶血弧菌感染实验中检测到HdPAP在血细胞中同样出现表达抑制现象, 3 h和6 h均检测到感染组HdPAP表达量显著低于对照组(P<0.05)。PAP在高温、缺氧及弧菌感染下显著的表达抑制从转录水平揭示了其作为表达下调的酯酶可能参与胁迫下的生物代谢和免疫反应。