马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒和驴强毒全基因核苷酸序列测定

本项研究以马传贫驴白细胞弱毒疫苗毒感染细胞总ＤＮＡ和驴强毒感染驴外周血病毒ＲＮＡ为起始材料,应用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ的方法,分段扩增出马传贫弱毒疫苗毒前病毒和驴强毒各基因,并将各基因克隆后进行测序。根据与国外发表的马传贫病毒核苷酸序列比较,推导出马传贫疫苗毒和马传贫驴强毒全基因组核苷酸序列。     

编码EIAV反式激活蛋白Tat的cDNA克隆和序列测定

ＥＩＡＶ在繁殖过程中的转录涉及到多种因子的调节,其中ＴＡＴ蛋白是病毒编码的反式激活因子,是病毒复制必须成分。ＴＡＴ是非结构蛋白,由病毒基因组全长转录产物经多次拼接而成。本研究使用ＥＩＡＶ疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物,在病毒增殖早期提取细胞总ＲＮＡ,反转录后使用中国ＥＩＡＶ毒株特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆后经过核苷酸序列分析,和与基因组全序列的比较。确定了编码ＥＩＡＶ反式激活蛋白的转录产物及阅读框架及转录后拼接位点,研究发现至少有两种拼接产物编码ＴＡＴ。     

应用反转录聚合酶链式反应检测鸡Th1样淋巴因子mRNA表？…

应用反转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和限制性酶切分析技术对鸡脾细胞体外受到有丝分裂原ＣonＡ刺激的情况下,其Ｔh1样淋巴因子mＲＮＡ的表达水平进行了研究。实验结 果表明,ＣonＡ诱导培养３个小时的鸡脾细胞表达α－干扰素（ＣhＩＦＮ－α）、γ－干扰素（ＣhＩＦＮ－γ）和白细胞介素－２（ＣhＩＬ－２）等鸡的Ｔh1样淋巴因子mＲＮＡ 。未诱导但培养了３小时的鸡脾细胞可表达ＣhＩＦＮ－α和ＣhＩＦＮ－γmＲＮＡ,而未     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株D971 mRNA3和mRNA4cDNA的分子特征

参照已发表的鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)基因序列，设计合成了1对引物，经RT—PCR扩增得到了IBV国内分离株D971约1．3kb的片段，其中包含3a、3b、E及M蛋白基因的完整0RF，并将该片段进行了克隆和序列测定。与国内外部分IBV毒株序列比较表明：D9713a基因与CU—T2、D1466、DE072、M41、GA／99和UK／66的3a基因核苷酸序列同源性在83％～89％之间，氨基酸序列同源性为77％～91％，其中与CU—T2毒株的同源性最低(分别为83％和77％)；3b基因与上述毒株的对应核苷酸序列同源性在85％～95％之间，氨基酸序列同源性为72％～96％，与CU—T2的同源性最高(分别为95％和96％)；E蛋白基因与CU—T2、D1466、DE072、M41、Ark99、H52、Gray、GA／99和UK／66的核苷酸序列同源性在81％～86％之间，氨基酸序列同源性为74％～80％。不同毒株推导的E蛋白C末端表现不同特征，其中D971E蛋白C末端比CU—T2的时应区多9个氨基酸残基，而比本试验选用的其他参考毒株的相应区域短5～7个氨基酸残基。M基因与Cu—T2、DE072、Gray、M41、H120、H52、SD／97／02、LX4及D41的M基因核苷酸序列同源性在86％～91％之间，氨基酸序列同源性为85％～95％，其中与SD／97／02的同源性最高(分别为91％和95％)。对M蛋白的3个功能区进行序列比较发现，其N端第1～19位与SD／97／02的同源性最高，达90％，与CU—T2的同源性为80％，而与其他毒株同源性均低于61％；N端第20～100位含有3个跨膜蔬水区，D971与其他参考毒株比较，该部位第20～67位相对保守，其中与SD／97／02的同源性为100％，与其他毒株的同源性在97％以下；在推测的与核衣壳连接的C端，D971与SD／97／02在第101～182位同源性为100％，与疫苗株H52和H120及国内分离株LX4和D41的同源性为97％，而与本试验所选的国外参考毒株同源性在96％以下；在C端第184～219位D971与H52的同源性为100％，与H120和SD／97／02的同源性为97％，与其他毒株的同源性也在96％以下，而且在C末端第220～222及224位与上述国内外参考毒株均不同，国内外各毒株在该4个位点氨基酸为丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸，而D971M蛋白的该区域氨基酸突变为丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸，该突变是否与D971的生物学特性尤其是组织嗜性的变化相关还有待于进一步研究。以上结果表明，D971与SD／97／02亲缘关系较其他毒株为近，但其遗传衍化又与国内使用的疫苗株H52和H120具有一定的联系。从其mRNA3和mRNA4cDNA的序列分析来看，D971又具有独特的分子特征。     

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株LH2/01/10纤突蛋白基因的遗传变异

 对传染性支气管炎病毒LH2/01/10的S1和S2基因分别进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定。结果表明,其S基因由3 495个核苷酸组成,编码的多肽由1 164个氨基酸残基组成。S蛋白的切割识别位点氨基酸组成为组氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸(HRRRR)。推测其裂解后形成的S1和S2亚单位中,S1由539个氨基酸残基组成,S2由625个氨基酸残基组成。序列分析发现:LH2/01/10与Beau、M41、CU-T2、D1466、DE072、Holte、Gray、Ark99、Conn、H52、KB85     

犬蝠源呼肠病毒的分离与鉴定

 【目的】从野生蝙蝠体内分离病毒，为开展蝙蝠的病原监测奠定基础。【方法】从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品，研磨后接种Vero E6细胞，从中分离到2株病毒，对其中一株病毒进行研究，使用生物学与分子生物学方法确定其分类学地位。【结果】该毒株在Vero E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变，表现为细胞内颗粒增多，细胞收缩、变圆，最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后，收集细胞及培养液，电镜观察发现，病毒粒子无囊膜，有双层衣壳，呈正二十面体对称，将病毒命名为Bat/China/2003（B/03）。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞，不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力、能耐受pH3.0的酸性环境、50℃水浴1 h病毒丧失感染能力、1 mol•L-1 MgCl2能提高病毒对热的抵抗力。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST分析表明，与呼肠病毒科正呼肠病毒属的Ndelle virus核苷酸同源性最高为91.2%。用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析，与哺乳动物呼肠病毒血清1、2、3型的代表株T1L，T2J，T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%。【结论】由以上结果推断该病毒为呼肠病毒科的成员。     

在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型 cDNA

 对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）、A/African starling/983/79（H7N1）和 A/Turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）。通过RT-PCR获得大约500 bp的禽流感病毒基因cDNAs片段，克隆，从重组质粒扩增DNA片段，并点到玻璃载体上，制成芯片。在病毒RNA反转录过程中，用Cy5标记样品 cDNAs。样品 cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型，依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点，杂交信号与预期设想基本一致。结果显示，DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。     

鸡白细胞介素15的研究进展

白细胞介素 1 5(IL -1 5)是 1 994年发现的一种能促进细胞生长和分化的细胞因子 ,主要由天然免疫细胞产生。鸡 IL-1 5是一种新发现的且与 IL-2活性相似的细胞因子 ,它作为疫苗佐剂研究的重要候选细胞因子有巨大潜力。文章主要围绕鸡 IL-1 5的发现、基因及蛋白结构、受体及生物学特性等作了综述。     

重组马传染性贫血病病毒核心蛋白抗原在 A GID 和ELISA中应用的评价

用昆虫杆状病毒表达系统获得的马传染性贫血病病毒（ Ｅ Ｉ Ａ Ｖ） 核心蛋白（ Ｇａｇ） 和 Ｐ２６ 蛋白, 作为免疫琼脂双扩散（ Ａ Ｇ Ｉ Ｄ） 和酶联免疫吸附试验（ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ） 抗原。对７６ 份已知马传贫非特异性血清进行检查, 同时与市售 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试剂盒作比较。证明, 用表达蛋白作抗原的 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测结果均为阴性反应, 而用市售 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 试剂盒检查有５４ 份马血清出现非特异性反应, 市售 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试剂盒检查也出现了非特异性反应, Ｏ Ｄ 值比表达抗原 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 高３５ 倍。初步证明在 Ａ Ｇ Ｉ Ｄ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法中, 表达抗原优于常规马传贫病毒抗原。     

鸡γ-干扰素基因在昆虫细胞/杆状病毒载体系统中的表达

摘要：将鸡（Gallus gallus）的γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB的BamHⅠ位点上，构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ，经限制性内切酶消化、ChIFN-γ特异引物PCR鉴定和序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ质粒与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经3轮蓝斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒rBaculovirus-ChIFN-γ。提取病毒DNA经ChIFN-γ特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒，命名为rBaculovirus-ChIFN-γ。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE,结果表明ChIFN-γ基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量约为19 kD。应用在大肠杆菌(Escherichia coli )原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ多克隆抗体进行Western blot分析，表明表达的重组蛋白具有抗原性。