应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。     

不同水稻种质中渗透胁迫抗性基因DREB2A的遗传多样性分析

本研究旨在分析转录因子DREB2A基因在不同水稻种质中的遗传多样性,以期为水稻耐渗透胁迫遗传改良提供分子工具。利用单倍型分析、系统进化树、遗传距离和密码子偏好性分析,对85份不同类型水稻种质中DREB2A基因的功能性核苷酸序列变异及遗传多样性进行了研究。共鉴定出55个核苷酸变异位点,其中12个位于编码区,43个位于非编码区;鉴定出12个DREB2A等位基因型,其中来自非洲栽培稻(Oryza glaberrima)的3个等位基因型表现大片段变异;根据DREB2A基因的序列变异鉴定出39个单倍型,其中33个为新单倍型;将所有单倍型分为三组（Group I、II和III）,其中非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中的10个单倍型单独分为一组(Group III);系统进化树、遗传距离和密码子偏好性分析均表明Group III与其他两组具有较大差异。对85份不同类型水稻种质中DREB2A基因的序列分析表明,非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中的DREB2A等位基因在序列变异、系统进化关系和密码子偏好性方面均明显不同于其他种质材料中的等位基因。     

杜马斯燃烧法和凯氏定氮法在土壤全氮检测中的比较研究

选用 6组不同全氮含量的土壤样品(梯度为 0%～0.06%、0.06%～0.1%、0.1%～0.2%、0.2%～0.3%、0.3%～ 0.4%和 0.4%～ 0.5%)和 4份土壤有效态成分分析标准物质为试验材料，分别采用杜马斯燃烧法和凯氏定氮法测定其全氮含量，并对两种方法测定结果的精密度、准确度和相关性及检测成本进行了比较分析。对土壤有效态成分分析标准物质全氮含量的检测，两种方法测定结果都接近于真实值，比较两种方法的相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)值，可确定杜马斯燃烧法精密度更高，且准确度更好；对于含氮量范围为 0%～ 0.06%的样品，两种方法的测定值之比(D/K)为 0.692～ 0.965，杜马斯燃烧法测定结果的变异系数为 0.00%～ 9.96%，测定结果不稳定，两种方法的测定值间存在显著的线性相关，但 R2仅为 0.9049；而含氮量大于 0.06%的样品，两种方法的测定值之比(D/K)为 0.940～ 1.104，变异系数均小于 5%，测定结果间存在显著的线性相关(R2=0.9979)。在检测成本方面，完成相同数量样品检测，杜马斯燃烧法所需时间和人力都约是凯氏定氮法的1/2。因而，杜马斯燃烧法是一种环保、高效的土壤全氮检测方法，对于含氮量范围为 0%～ 0.06%的土壤样品，凯氏定氮法的测定结果更接近于真实值，而对于含氮量大于 0.06%的土壤样品，杜马斯燃烧法更加适用。     

农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T₁代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-1 6-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1（无其他生长素）的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO₄显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T₀代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T₁代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

农户生计视角下的休耕补偿模式研究——以河北省平乡县为例

休耕补偿作为一种促进耕地保护的政策,就其保障国家粮食安全,促进农业经济可持续发展的目的而言,需将补偿重点落到真正以耕地作为生计来源的农户上。文中运用机会成本法测算河北省平乡县不同生计来源农户的休耕(休耕的)机会成本,并构建了劳动力转移补偿模式。结果表明:1)农业劳动力休耕的机会成本为443. 2元/亩;非农劳动力休耕的机会成本为231. 4元/亩; 2)在劳动力转移补偿模式中,假定休耕面积不变,预计未来十年间农业劳动力的补偿总额将从基准年的739. 1万元下降至124. 7万元,非农劳动力的补偿总额将从基准年的794. 5万元增加到1115. 2万元,休耕补偿总额将从基准年的1533. 5万元下降至1239. 9万元; 3)当前的休耕补偿不仅未能着重补贴到农业劳动力上,且加重了政府财政负担,使得休耕效率较低。     

寄主植物中抑制十字花科黑腐病菌Ⅲ型分泌系统小分子化合物的鉴定

 寻找抑制植物病原菌III型分泌系统的植物源活性小分子化合物,是研发生物安全农药的重要途径之一。本研究采用水煮提取法从十字花科黑腐病菌寄主植物满身红萝卜中提取分离活性小分子化合物,利用高效液相-质谱联用解析出活性物质的单体结构。然后用荧光素酶基因luxAB构建融合报告系统以及定量PCR检测活性物质对十字花科黑腐病菌III型分泌系统的抑制效果,最后采用剪叶接种和压渗接种的方法研究活性小分子物质对十字花科黑腐病菌的生防作用。研究表明,植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇对十字花科黑腐病菌III型分泌系统基因的转录表达有一定程度的抑制作用,但是对I、II、IV型分泌系统基因的表达没有明显的抑制作用。植物鞘氨醇在XCM1上影响菌的生长,而二氢鞘氨醇不影响菌的生长。同时,还发现这两种物质能显著降低Xcc在寄主植株满身红萝卜上的病害症状以及能够使Xcc在非寄主植物辣椒上引起过敏反应的能力丧失。该研究结果为深入研究小分子化合物对十字花科黑腐病菌III型分泌系统的作用机制及后续开发植物源抑制剂提供了一定的理论依据。     

基于不同人工鱼巢研究黄颡鱼的产卵偏好性

为探索黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)繁殖时期对人工鱼巢的偏好性, 2018年6—7月开展了不同水温条件下黄颡鱼对不同鱼巢颜色和材质产卵偏好性的对比实验。实验用产卵鱼巢为半球形棕榈空鱼巢(直径25 cm,深12 cm);同规格内部放置4～6枚碎石块的棕榈鱼巢和塑料鱼巢;折叠6层尼龙渔网(30cm×40cm)和棕榈片(30cm×40cm)鱼巢,于水泥池(290 cm×120 cm×100 cm)内开展两种温度区间条件下产卵偏好性实验。实验用黄颡鱼亲本雌雄比例为1:1,雌鱼体长(167.8±19.0)mm,体重(99.9±21.7)g;雄鱼体长(235.1±18.8)mm,体重(188.5±38.1)g。结果表明,在24～26℃水环境下,半球形棕色棕榈(无石子)鱼巢内个体平均附卵量为628.49粒/m2,个体单位面积平均附卵率为2.77%;28～32℃水环境下,半球形棕榈(无石子)个体平均附卵量为225.48粒/m2,个体单位面积平均附卵率为1.40%。结果分析发现, 24～26℃是黄颡鱼产卵的最适水温区间;黄颡鱼对棕色鱼巢产卵偏好显著(P0.05),而对灰色、粉色、黄色和绿色无明显偏好;黄颡鱼对半球形棕榈(无石子)鱼巢产卵偏好显著(P0.05),而对其他材质鱼巢的偏好性依次为:半球形棕榈(有石子)平铺棕榈片悬挂棕榈片半球形塑料水泥池。可见,黄颡鱼产卵的最佳偏好为24～26℃水环境下棕色半球形棕榈鱼巢。本研究结果对黄颡鱼的人工繁殖、产沉黏性卵鱼类产卵场的修复和资源增殖有重要的指导意义。