农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T1代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L~(-1) KT、0.5 mg·L~(-1) 6-BA和0.05 mg·L~(-1) NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L~(-1)的IBA的SM1(无其他生长素)的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L~(-1) CuSO4显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T0代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T1代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。     

一种CRISPR-Cas9介导的拟南芥高效基因编辑系统的构建与应用

【背景】近些年兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种植物中实现了高效的基因打靶,为基因功能研究提供了一种高效快速的方法,但一些CRISPR-Cas9载体编辑效率很低。【目的】通过构建一种由RIBOSOMAL PROTEIN S5 A（RPS5A）启动子启动Cas9并带有红色荧光蛋白筛选标记的CRISPR-Cas9载体,提高拟南芥CRISPR-Cas9编辑效率,并利用这套系统对拟南芥木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因TOUCH4（TCH4）进行编辑。【方法】在pKSE401载体的基础上,以从胚胎发育早期就表现出高转录活性的RPS5A启动子替换35S启动子、以DsRed2替换潮霉素抗性基因,构建拟南芥中使用的CRISPR载体pRSE-WH;以AtTCH4为靶基因,使用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn）设计靶位点,将所设计的靶点序列在拟南芥参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出2个靶位点target 1和target 2。化学合成带有接头的靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pRSE-WH载体连接,构建TCR1和TCR2表达载体,采用农杆菌介导的沾花法侵染野生型拟南芥Col-0,以红色荧光蛋白为标记筛选获得T₁代转基因阳性植株。通过靶位点扩增测序法判断T₁代转基因植株在预期靶位点是否发生编辑,根据测序结果的峰图对编辑情况进行解码,进一步分析突变类型及基因型。【结果】构建了一个在拟南芥中高效编辑的CRISPR载体pRSE-WH。TCR1和TCR2成功地实现了对TCH4的定点编辑,靶点一的编辑效率为80%,靶点二的编辑效率为100%,总编辑效率为86%。根据测序结果的峰图解码了T₁代植株的突变结果,纯合编辑、杂合编辑、双等位编辑均有出现。对不同的编辑类型进行统计发现,59株T₁代阳性植株中,无编辑8株,占比13.56%,纯合编辑9株,占比15.25%,双等位编辑40株,占比67.80%,杂合编辑2株,占比3.39%。在T₁代发生纯合编辑以及双等位编辑的株系中选择了无红光种子进行繁种,并对T₂代植株编辑情况进行测序检测,结果发现T₁代中的突变成功遗传到了T₂代无Cas9株系中。【结论】pRSE-WH在拟南芥中展现了极高的编辑效率,并且通过对种子进行红色荧光筛选,能够简便地获得无Cas9且稳定遗传的T₃代突变体。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T₁代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T₂代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g ^-1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g ^-1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。     

银叶树对Pb、Cd、Cu污染模拟湿地的适应性和修复潜力

【目的】探究银叶树(Heritiera littoralis)对重金属污染湿地环境的修复潜力。【方法】以银叶树为研究对象,在盆栽条件下模拟湿地环境,以不添加重金属为对照(CK),探究T₁(50 mg·L^-1Pb+5 mg·L^-1Cd+100 mg·L^-1Cu)、T₂(100 mg·L^-1Pb+10 mg·L^-1Cd+200 mg·L^-1Cu)、T₃(200 mg·L^-1Pb+20 mg·L^-1Cd+400 mg·L^-1Cu)3个复合污染水平(处理)对银叶树幼苗生长、养分吸收及Pb、Cd、Cu累积量的影响。【结果】与CK相比,T₁对银叶树根部生物量无显著影响,而T₂、T₃显著抑制根部生物量生长,3个处理银叶树的株高、地上生物量、总生物量与CK无显著差异;T     

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN₂及HN₃处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN₂到HN₃）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。     

烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草（Nicotiana tabacum L.）碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体（nic1和nic2）中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。     

利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用

【目的】FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因。为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体。同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米B104为材料,克隆ZmFKF1,通过序列比对明确ZmFKF1的基因结构。以ZmFKF1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶点,将设计的靶点序列在玉米参考基因组中进行比对分析,排除非特异性靶位点,最终筛选出在ZmFKF1第1外显子上的靶位点ZmFKF1-T1,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。利用农杆菌介导法,转化玉米B104幼胚,通过抗性筛选获得抗性愈伤组织,之后诱导出芽和生根,获得T₀代ZmFKF1编辑阳性植株,并利用cas9特异引物进行验证。利用靶位点扩增测序法,明确T₁代ZmFKF1编辑植株在ZmFKF1预期靶标位点是否发生突变及突变的类型,筛选获得ZmFKF1定点突变纯合株系。获得这些材料后,以野生型B104为对照,统计和分析开花表型。同时,利用实时荧光定量PCR技术检测上述材料中与玉米开花途径相关的关键基因的表达量变化,对表型进行进一步的验证。【结果】在玉米FKF1的第1外显子上设计靶点构建基因编辑表达载体,通过遗传转化获得的转基因株系实现了对ZmFKF1的定点突变,共获得T₀代ZmFKF1编辑阳性株系18株,在预期靶标位点上发生突变的有6株,2种不同的突变类型：单碱基插入和多碱基缺失。通过开花时间统计和分析,与野生型B104相较,3个T₂代ZmFKF1编辑纯合突变体的开花时间延迟,显著（P＜0.05）晚于B104。进一步对这些材料中的开花关键基因ZmGI、conz1和ZmZCN8进行表达量检测,发现突变体中这些基因的表达明显（P＜0.05）低于野生型B104,与晚花表型相符。【结论】可利用CRISPR-Cas9技术对ZmFKF1进行定点编辑获得基因编辑突变体,且突变体开花时间明显延迟。     

转phyA2、ZmTMT和Bar玉米的获得及其特性分析

【目的】玉米是家禽和单胃动物饲料的主要原料,但玉米籽粒中高活性的α-生育酚含量较低,且籽粒中的磷主要是以植酸磷的形式存在,动物不能有效吸收利用,因此,饲料中需要添加化学合成的维生素E和无机磷或微生物来源的植酸酶以满足动物生长发育的需要,增加了饲料成本,同时又容易造成磷污染。通过转基因获得α-生育酚含量和植酸酶活性大量提高的玉米,为饲用玉米育种提供材料基础。【方法】构建含有3个基因表达盒的载体,采用农杆菌侵染的方法转化玉米,草铵膦作为筛选压力;通过喷施草铵膦和PCR鉴定的方法筛选转基因阳性植株,RT-PCR分析目的基因在转录水平的表达情况;Western blot分析目的基因在翻译水平上的表达情况,采用分光光度计测定转基因玉米籽粒中的植酸酶活性,利用HPLC测定籽粒中的维生素E含量,同时比较转基因株系与野生型在其他营养成分和农艺性状上的差异。【结果】构建了胚乳特异性启动子123387驱动的植酸酶基因phyA2表达盒、胚特异性启动子13387驱动的玉米γ-生育酚甲基转移酶基因ZmTMT表达盒以及组成型启动子CaMV 35S驱动的草铵膦抗性基因Bar表达盒串联的植物表达载体;转化玉米获得转基因植株;喷施草铵膦和PCR鉴定得到阳性植株;经过多个世代回交转育,获得目标性状均较好的2个转基因纯合玉米株系TPB1和TPB2;RT-PCR和Western blot分析结果表明phyA2、ZmTMT和Bar在转基因玉米中显著高表达。植酸酶活性测定结果表明,转基因玉米籽粒中植酸酶活性达到10 000—13 000 U·kg^-1。维生素E含量测定结果表明,转基因玉米籽粒中90%以上的γ-生育酚转化为α-生育酚,α-生育酚的含量达到50—70 mg·kg^-1,α-三烯生育酚的含量也有明显增加。转基因玉米中的植酸酶活性和α-生育酚含量完全能够满足动物饲料的需要。转基因株系的农艺性状与野生型无显著差异,TPB1的营养成分与野生型总体无显著差异,TPB2稍高于野生型但是未产生不利影响;且均具有草铵膦抗性。【结论】获得的富含维生素E和植酸酶、且具有除草剂抗性的玉米新材料可以用于玉米杂交种的开发应用,降低饲料成本,提高磷的利用率,减少环境污染。     

HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默（HIGS）的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H₂O₂的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS（SS1G_00102）全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04,与灰霉病菌BcCCS（EDN25358）亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T₁及T₂代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T₂代中获得3个稳定表达的T₃代HIGS-CCS转基因拟南芥株系：HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H₂O₂的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。     

白花除虫菊高效再生体系的建立

【目的】筛选出适宜白花除虫菊外植体的消毒方法、外植体诱导、继代培养及生根培养阶段适宜的培养基配方，建立白花除虫菊高效再生体系。【方法】以白花除虫菊尚未张开的花蕾作为再生体系的外植体材料，花蕾经过灭菌消毒以后，采用MS固体培养基，比较不同种类植物生长调节剂浓度配比对白花除虫菊花蕾诱导出芽、增殖及生根等关键环节的影响。【结果】白花除虫菊花蕾外植体最适宜的消毒条件为75%酒精处理30 s后用0.10%氯化汞溶液消毒10 min，之后用15%次氯酸溶液处理15 min；白花除虫菊花蕾诱导芽的最适培养基为MS+2.0 mg·L^-16-BA+0.5 mg·L^-1TDZ+0.2 mg·L^-1IBA；白花除虫菊芽增殖的最适培养基为MS+1.0 mg·L^-16-BA+0.1 mg·L^-1TDZ+0.1 mg·L^-1IBA；白花除虫菊生根的最适培养基为MS+0.1 mg·L^-1IAA+0.1 mg·L^-1IBA；炼苗移栽的最适基质为...     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11（ZH11）的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T₀代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T₂代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T₂后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。     

森林草莓FveD27的表达特性和功能

【目的】新型植物激素独脚金内酯是调控植物分枝发育的关键因子,但独脚金内酯在草莓生长发育中的作用尚不清楚。揭示森林草莓（Fragaria vesca）中独脚金内酯生物合成关键基因DWARF27（D27）的表达特性及主要功能,探索FveD27在草莓分枝以及生长发育过程中的作用,为研究草莓植株构型奠定理论基础。【方法】本研究选用森林草莓作为试验材料,利用RT-PCR方法克隆FveD27的编码区序列,利用MEGA 6.0分析草莓FveD27与苹果、拟南芥等物种中D27的系统进化关系;构建FveD27与GFP的融合载体,利用注射烟草叶片的方法对FveD27进行亚细胞定位分析;通过qRT-PCR技术对FveD27在森林草莓不同器官的表达水平进行定量分析,同时构建FveD27启动子与GUS融合表达载体并通过农杆菌介导法将其转化到森林草莓中,利用GUS染色进一步分析FveD27的表达特性;构建FveD27过表达载体并通过农杆菌介导的叶盘法进行稳定遗传转化,获得FveD27过表达草莓株系。【结果】从森林草莓中克隆出编码区长度为789 bp的FveD27序列;烟草的亚细胞定位结果表明FveD27定位在叶绿体;FveD27在森林草莓组织器官中的表达量由高至低依次为幼叶、茎尖、叶柄、成熟叶、根;克隆出长度为1 670 bp的FveD27启动子序列,GUS活性分析结果显示转pFveD27::GUS融合基因草莓植株的幼叶和芽等部位GUS活性较强,而成熟叶与叶柄部位GUS活性较弱,根部几乎无GUS活性,GUS染色分析揭示的基因表达结果与qRT-PCR结果相符;构建了FveD27过表达载体并通过农杆菌介导获得了过表达FveD27的草莓转基因株系,表型调查结果表明过表达FveD27能够显著抑制新茎分枝的形成,同时增加花序数量。【结论】FveD27具有调控森林草莓新茎分枝发育、花序数量等功能。研究结果可为调控草莓新茎分枝数量和产量等提供新思路。     

葡萄钾离子转运基因VviHKT1;7在盐胁迫下的功能鉴定

【目的】探讨VviHKT1;7在葡萄抗盐机制中的作用,为后续培育抗盐品种提供理论参考。【方法】利用DANMAN和MEGA软件对葡萄HKT进行生物学信息分析。以抗盐性较强的砧木SA15和SA17以及生产上常用砧木1103P组培苗为材料,用100 mmol·L^-1NaCl分别处理0、3、6、12、24和48 h,以清水处理相应时间为对照,荧光定量PCR（qRT-PCR）检测HKT1在葡萄根部的相对表达量;以SA17的cDNA为模板克隆基因,连接表达载体pRI101-AN-GFP,利用农杆菌侵染法侵染拟南芥花序,在抗性MS板上筛选直到获得T₃纯合株系;将野生型与转基因拟南芥种子播种于MS板和含有150 mmol·L^-1NaCl的MS板上,观察其发芽和生长情况并统计根长及鲜重;利用发根农杆菌技术获得SA17转基因葡萄根系,100 mmol·L^-1NaCl处理24 h后,利用基于非损伤微测技术的NMT活体生理检测仪检测野生型和转基因葡萄根系Na⁺的净流量以及盐胁迫下K⁺瞬时流量。【结果】多序列比对和系统进化树分析表明,葡萄HKT之间同源性较高,其中VviHKT1;7开放阅读框序列长度为1 380 bp,与VviHKT1;6的亲缘关系最近。盐胁迫显著诱导了葡萄HKT1在3个品种中的表达,其中VviHKT1;7的相对表达量上调较高,长时间胁迫后表达量仍有上升趋势,胁迫6或12 h时表达量达到峰值,且在耐盐性强的SA17、SA15中表达量明显高于1103P。拟南芥的发芽与生长结果表明,正常情况下野生型和转基因拟南芥的发芽和生长情况无显著差异,但盐胁迫下转基因拟南芥的发芽率、根长、鲜重明显高于野生型。荧光检测结果表明,转基因葡萄根系在荧光下可以明显看到绿色荧光,而野生型根系检测不到荧光;进一步qRT-PCR检测结果表明,转基因葡萄根系中VviHKT1;7的表达量是野生型根系的20多倍。离子流速检测结果表明,正常情况下野生型和转基因根系Na⁺净流量显示出外排,各个时间段的波动幅度较小且无显著差异,平均净流量分别为208和205 pmol·cm^-2·s^-1;盐胁迫后,两者Na⁺净流量明显增大,各个时间段的波动幅度增大,平均净流量分别为1 053和1 340 pmol·cm^-2·s^-1。正常情况下两种根系K⁺吸收与外排处于动态平衡状态,盐胁迫显著诱导K⁺外排,转基因根系的外排量明显小于野生型,分别为406和952 pmol·cm^-2·s^-1,表明转基因植株根系的Na⁺外排、K⁺保持能力明显大于野生型。【结论】VviHKT1;7在葡萄响应盐胁迫中发挥着重要作用,过表达该基因可以提高拟南芥和葡萄根系在盐胁迫下的适应能力。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

陆地棉盐胁迫应答基因GhPEAMT1的克隆及功能分析

【目的】磷酸乙醇胺N-甲基转移酶（phosphoethanolamine N-methyltransferse,PEAMT）是植物磷酸胆碱合成的关键酶,而磷酸胆碱是可以增强植物抗性的甘氨酸甜菜碱合成底物胆碱的前体。通过对陆地棉磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（GhPEAMT1）的克隆、表达模式分析,以及功能验证,探究GhPEAMT1在陆地棉响应盐胁迫中的生物学功能,为棉花耐盐品种的选育提供基因资源。【方法】根据转录组测序数据分析,最终确定GhPEAMT1为耐盐候选基因;通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因;通过生物信息学分析基因结构特征、预测蛋白质相对分子质量以及进化关系;利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析耐盐棉花品种早熟长绒7号和感盐棉花品种南丹巴地大花在NaCl胁迫后不同时间点不同组织的表达特征;构建亚细胞定位载体,进行烟草的瞬时转化,确定蛋白质在细胞中的位置;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,分析转基因拟南芥种子在盐胁迫下的萌发率和转基因拟南芥主根长度;利用病毒诱导基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）对早熟长绒7号棉花品种进行目的基因沉默,提取棉花叶片的RNA进行实时荧光定量用以检测基因沉默效率,随后用40 g·L^-1的NaCl溶液的处理对照棉花植株（CK）、注射TRV2:00的棉花植株、GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株,测定棉花叶片过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPX）的活性。【结果】克隆获得GhPEAMT1的2个同源基因GhPEAMT1A和GhPEAMT1D,2个基因的CDS全长分别为1 488和1 485 bp;构建进化树发现,GhPEAMT1与海岛棉同源基因的亲缘关系最近,而与其他物种相比,与可可同源性最高;盐胁迫条件下,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D在耐盐品种早熟长绒7号叶片和根中的表达量显著高于感盐品种南丹巴地大花。亚细胞定位显示该基因位于细胞质中;超表达转基因拟南芥后,在100和150 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的种子萌发率显著高于野生型拟南芥。在50和100 mmol·L^-1 NaCl的MS培养基上,转基因拟南芥的主根长极显著高于野生型拟南芥的主根长;用40 g·L^-1的NaCl溶液处理24 h后,GhPEAMT1A和GhPEAMT1D沉默成功的棉花植株叶片比CK和注射TRV2:00的棉花植株的棉花叶片萎蔫严重,盐胁迫后,与注射空载棉花植株相比,注射TRV2::GhPEAMT1A棉花植株过氧化氢酶（CAT）活性降低、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性降低。【结论】GhPEAMT1可以增强拟南芥对盐胁迫的耐性,GhPEAMT1能够响应盐胁迫并起正向调控作用。     

超表达OsPR1A增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性反应

【背景】前期研究发现,水稻病程相关蛋白质OsPR1A的表达受上游抗病基因Xa21调控,接菌后早期启动Xa21介导的OsPR1A较高水平表达对水稻抵抗白叶枯病菌至关重要。同时OsPR1A也受到水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）的诱导表达。对于OsPR1A的研究绝大部分是作为抗性反应发生的标志基因佐证其他基因或途径在抗性中的作用,缺乏直接的证据证实OsPR1A本身的生物学功能。【目的】通过获得OsPR1a-OX超表达转基因植株,调查其表型及农艺性状,并明确OsPR1A蛋白质表达与抗性的关系,为鉴定OsPR1A功能提供依据。【方法】通过农杆菌介导法,将构建的OsPR1a-OX转化载体转入到水稻受体4021中,利用PCR和免疫印迹（western blot,WB）技术分别在基因水平和蛋白质水平上筛选并鉴定OsPR1A超表达阳性纯合株系。在成熟期,调查OsPR1A超表达转基因植株的表型及农艺性状（株高、穗长、分蘖数、结实率和籽粒大小等）。在31℃条件下,将生长2周的水稻幼苗TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株接种水稻白叶枯病菌,并在接菌0、2、4、6、8、10和12 d时测量病斑长度。在接菌0、4和6 d时,收集TP309、4021和OsPR1A超表达转基因植株的水稻叶片,提取蛋白质,利用WB技术检测OsPR1A的表达特征。【结果】构建了OsPR1a-OX转化载体,并转入到受体4021中,筛选并鉴定到2个OsPR1A超表达转基因纯合株系（#704和#709）。调查了OsPR1A超表达转基因植株在成熟期的表型及农艺性状,与对照4021相比,#704和#709的株高较矮、穗长较短、分蘖数减少、结实率降低,但籽粒稍大,可能与结实率低有关。在31℃条件下,OsPR1A超表达转基因植株的病斑长度与对照4021相比明显缩短,结果具有显著性差异（P<0.05）。在接菌0、4和6 d的材料中,超表达转基因植株#704和#709中OsPR1A始终有较高水平的表达丰度,从而提高了对白叶枯病菌的抗性。【结论】采用农杆菌介导法,获得OsPR1A超表达转基因植株;超表达OsPR1A影响到水稻的正常发育过程;超表达OsPR1A后增强了Xa21介导的水稻对白叶枯病的抗性。