5头经玻璃化冷冻保存后移植的成年体细胞克隆牛降生

2003年7月19日，经过剖腹产．一头体重60kg的足月体细胞克隆牛在青岛平度降生。随后,在7月22日至10月26日之间又产下4头足月克隆牛犊。5头均为活产。这是世界上首次报道利用“去透明带双半卵融合技术”获得的成年体细胞克隆牛，也是我国首次成功获得经过玻璃化冷冻保存后的胚胎移植产下的体细胞克隆牛。这是广西大学动物繁殖研究所与加拿大国际新技术发展集团开展国际问科研与产业开发合作的结晶,也是继1995年7月广西大学(原广西农业大学)与华南师范大学合作成功获得我国首例胚胎细胞克隆牛后，广西大学取得的又一个成果。这群成年体细胞克隆牛是采用较独特的“去透明带双半卵融合技术”克隆生产的(方法详见谭世俭等，广西农业生物科学,2003，22(3)：201～206)。体外成熟的牛卵母细胞经显微盲吸法去核及去除透明带(简称为半卵)。供核体细胞取自加拿大一头18月龄高产奶牛的耳皮下成纤维细胞。电融合前，将两枚半卵和一枚供体细胞用植物凝集素按细胞纵轴水平粘合在一起，经AC电场使细胞排序，再施于单次DC电脉冲诱导3细胞融合。重构胚采用微穴法体外培养。7～8d的克隆囊胚采用玻璃微管法玻璃化冷冻保存(谭世俭等，广西农业生物科学，2002，21(1)：1～7)。结果在批量生产的条件下，卵母细胞去核率达96．2％(301／313，N=4)，电融合率为95．7％(3678／3842，N=36)，卵裂率87．2％(3180／3645)、囊胚率42．2％(1540／3645)，冻胚率31．4％(1145／3645)。经玻璃化冷冻保存的胚胎于2002年l0月至2003年1月间分23个批次进行移植。胚胎移植30d后用超声波仪检查，确诊48头妊娠，受胎率为28．1％(48／171)。出生的5头克隆牛犊中，除1头自然分娩(2003年10月12日生)的牛犊健康存活至今(2个半月)外，其余4头在母牛发生难产时行剖腹产术取出的克隆牛犊有3头在产后不到1h内即先后夭折；另1头存活了5d。     

提高猪核移植效率的研究进展

哺乳动物体细胞核移植(克隆)经过多年的发展,获得了多种后代。猪的核移植研究意义重大,应用价值颇高,是当今生物技术的热点研究之一。尽管猪核移植已取得了很大进展,但移植效率依然很低。本文就目前已有的资料,综述了提高猪体细胞核移植效率的各项技术环节的研究进展。     

徒手克隆过程中的技术环节对体细胞克隆效率的影响

随着体细胞核移植技术的发展,如何快速高效的获取克隆后代已然成为科研工作者们关注的重点。本文针对受体母猪受胎率和单胎产仔数较低的问题,以本实验室徒手克隆技术平台为出发点结合多年的实验经验及实验结果,从卵巢采集、徒手克隆过程、受体母猪准备、胚胎移植和受体母猪饲养管理等方面归纳总结克隆猪各个技术环节的要点。系统的介绍了影响猪体细胞核移植效率的因素及改善和优化措施,从而在胚胎移植过程中可稳定、高效的获得克隆小猪。为克隆技术的推广和应用提供技术支持。     

整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞系的建立

通过转基因动物乳腺表达系统生产重组药用蛋白比微生物发酵系统和动物细胞培养系统具有很多优势;同时,体细胞核移植技术为制备动物乳腺生物反应器开辟了一条新的途径。本实验旨在建立稳定整合人乳铁蛋白cDNA的山羊胎儿成纤维细胞系,为体细胞核移植法制备转基因动物提供可靠的供体细胞。本研究采用RT-PCR获得人乳铁蛋白cDNA,通过Long and Acute PCR扩增山羊β-酪蛋白5’ 端6.5 kb的调控序列,以pEGFP-C1为骨架构建乳腺特异性表达载体 p6.5hLF-EGFP。脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,G418抗性筛选3-4周后,经PCR扩增和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞系,为制备高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高可靠的核移植供体细胞。     

水牛体细胞核移植相关影响因素的研究

主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin,APD）培养处理24h,再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05）,但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％,P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁,另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05）,但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％,P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％,P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率;（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞,而且以雌性的效果较好。     

昆明小鼠内细胞团和滋胚层细胞注入去核2-细胞胚的核移植研究

采用核移植技术将单个细胞注入去核2-细胞卵裂球中,比较来自于囊胚的内细胞团(ICM)和滋胚层细胞(TE)产生孕体或嵌合体的发育潜力。用TE和ICM重构胚胎的发育潜力,主要取决于注射hCG后从输卵管收集到的2-细胞胚胎的时间。在注射hCG后38～42 h和43～46 h收集得到的2-细胞胚胎,其重构胚胎仅仅能够发育到4-细胞期。注射hCG后48～51 h收集得到的2-细胞胚胎,重构后发生卵裂的胚胎比率显著提高,有少部分会发育到囊胚期。用诺考达唑(Nocodazole)处理这些重构胚,发生卵裂的胚胎比率会显著提高,并且有部分重构胚发育到囊胚阶段。将这些囊胚移植到受体鼠中,在其妊娠中期未检测到供体核的出现。用ICM和TE进行重构得到的嵌合2-细胞胚胎,其体外发育潜力有限,本试验中也未得到嵌合孕体。     

牛乳腺干细胞核移植

近些年来,体细胞核移植虽然取得了很大的进步,但核移植效率仍然很低,而供核细胞的选择对于核移植效率起着关键的作用.本研究针对牛乳腺干细胞(mammary stem cells,MSCs)和牛乳腺上皮细胞(mammary epithelial cells,MECs)作为核移植的供核细胞,比较了重构胚发育率和核移植胚胎干细胞分离率的差异,发现来源于MSCs的重构胚的卵裂率为69%(331/479),囊胚发育率为27%(130/479);来源于MECs的卵裂率为71%,囊胚发育率为17%(84/495).囊胚发育率差异显著(p＜0.05).试验从176个核移植重构囊胚分离培养胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells),发现来源于MSCs的重构胚的NTES贴壁率为44%(39/88),来源于MECs的NTES贴壁率为28%(25/88),NTEs的贴壁率差异显著(p＜0.05).以上数据表明,来源于MSCs的重构胚具有较高的发育潜能.     

蛋白酶抑制剂MG-132对牛核移植重构胚重编程的影响

旨在探讨MG-132对牛体细胞核移植重构胚重编程的影响。将牛卵母细胞体外培养至MI期,添加不同浓度的MG-132(0、3、5、7、10μmol·mL-1),至成熟后进行激活,通过胚胎的发育情况得出MG-132的合适浓度,并用此浓度的MG-132作用于核移植全过程,来研究MG-132的作用,用免疫组化的方法进一步验证结果。结果,5、7μmol·mL-1MG-132组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组和2μmol·mL-1组(P0.05),但这2组间无显著差异(P0.05),而10μmol·mL-1组卵裂率只有23.44%,低于其他各组(P0.05);成熟卵母细胞在5μmol·mL-1MG-132中分别作用0、2、4h激活后,卵裂率、囊胚率均无显著差异(P0.05),而6h组激活后卵裂率、囊胚率均明显降低(P0.05);核移植操作过程中添加MG-132组的卵裂率与对照组相比无显著差异(P0.05),而桑葚胚和囊胚率都较对照组显著升高(P0.05);未添加MG-132组,融合后1h供体细胞几乎无变化,4h后核纤层蛋白(lamin)着色显著,说明染色体凝集不完全;添加组融合4h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。上述结果说明5μmol·mL-1MG-132能够促进重构胚的重编程,但对重构胚移植后的附植和妊娠作用还有待进一步研究。     

动物异种核移植的研究进展

论述了种间核移植的历史发展现状、应用前景和存在问题以及体细胞核移植技术在研究核质互作、细胞核的分化和重新编程方面重要的理论意义。     

日本克隆牛技术的研究进展

本文通过考察日本从事新生殖生物技术的研究单位，并参阅有关试验研究的资料，着重介绍了日本近几年来克隆牛技术的研究现状与发展趋势，并对胚胎细胞和体细胞的克隆牛技术、存在问题和今后研究的方面等作了阐述。