转基因抗虫玉米研究及应用

Bt是转基因抗虫玉米育种应用的主要外源基因,包含编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的Cry类和Cyt类基因,以及编码营养期杀虫蛋白(Vip)的vip类基因.迄今已有40余种转Bt基因玉米事件被26个国家批准进入商业化种植或饲料食品加工.目前,Bt基因研发仍在进行,并逐步向分离克隆和改造新基因以及构建高效表达载体方向发展.转Bt基因育种工程逐渐扩大靶标昆虫抗性范围,并向复合性状抗虫玉米发展.转化技术亦向高效化和安全化发展.综述了Bt基因作用机理、转Bt基因玉米研发及应用,拟为我国转Bt基因抗虫玉米研发提供参考.     

转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性

为明确转Bt基因玉米对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的抗性,采用室内玉米离体组织生测法测定取食转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101心叶、花丝和籽粒后草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫存活数量、存活幼虫的体重、蛹重、化蛹和羽化等参数,分析转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101三种组织对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性。结果显示,转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101心叶可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为10.0%,但不能化蛹与羽化;花丝可杀死大部分草地贪夜蛾1龄幼虫,存活率为3.3%,并阻断其生活史,但对2龄幼虫杀伤力弱,存活率为73.3%,存活幼虫化蛹率和羽化率分别为20.0%和13.3%;籽粒可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为13.3%,有少量可化蛹,化蛹率为3.3%、有少量羽化,羽化率为3.3%。表明转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101在短期内对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫有良好的控制作用。     

玉米自交系对灰斑病抗性配合力及遗传参数分析

以6个灰斑病抗性不同的玉米自交系为亲本,按Griffing双列杂交试验设计方法Ⅱ组配15个杂交组合,对叶片病斑覆盖度进行配合力分析,并估算遗传参数。结果表明,6个自交系一般配合力(GCA)效应差别较大,齐319表现高抗;其次是鲁9801、B84和8112;9046和掖478表现感病。结合杂交组合实际表现与特殊配合力效应进行分析,齐319所组配的各组合抗性表现均较好;掖478与8112、9046、B84组配的各组合抗性差;由9046所组配的组合特殊配合力效应好。进一步对遗传参数的分析表明,该性状广义遗传力为64.49%,性状的遗传以加性效应为主,同时存在一定的非加性效应,性状表现受环境影响较大。     

抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因表达载体构建及在玉米中的遗传转化

玉米病毒性病害和杂草严重影响其产量和品质。以pCAMBIA5300为基础载体,应用In-Fusion克隆技术构建了双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS,其中含有抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因和磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS基因,分别由玉米泛素Ubi启动子和花椰菜花叶病毒35 S启动子启动。以玉米种子黄化苗的茎尖分生组织为受体,用农杆菌介导法进行遗传转化,将抗双链RNA依赖性蛋白激酶基因PKR和抗除草剂草甘膦基因EPSPS导入玉米自交系掖478中,获得转基因植株及其子代。     

玉米产量性状“一致性QTL”分析

在构建含221个玉米产量性状QTL整合图谱的基础上,采用元分析方法,当LOD值≥4.0时,在第2染色体上确定了1个控制粒重和穗数的“一致性QTL”,介于标记Sdg107和Isu2117b之间,间距30.99 cM;同样,在第3和第4染色体上发掘了2个控制穗数和粒重的“一致性QTL”,分别由标记ucsd72d和IDP37...     

玉米opaque2近等基因系中相关基因的表达量分析

Opaque2(O2)基因编码产生OPAQUE2蛋白,该蛋白为碱性亮氨酸拉链家族的一种转录因子,可作用于基因的启动区,调控基因的转录。辽2345/o2为本实验室构建的辽2345的opaque2(o2)基因回交导入系,蛋白组学分析表明,辽2345与辽2345/o2在授粉后18 d的胚乳细胞中表达蛋白的种类和数量存在很大差异,从中筛选出差异较明显的9种蛋白质。为了进一步验证O2与9种蛋白间的作用关系,应用相对荧光定量PCR的方法对9种蛋白进行了RNA水平表达量的检测。结果表明,在胚乳发育过程中Chfi很可能受到O2的抑制作用,O2很可能对Ubc、Lgl、Sdh、LOC541920、Shmt、Ppdk等基因存在某种促进或激活作用。     

一种基于PCR技术混合样本高效定性筛查转基因阳性样本的方法

【目的】基于PCR技术与DNA样本混合策略建立一种高效定性筛查大量待检样本中转基因阳性样本的方法。【方法】以480个样本为研究案例,对待检样本DNA模板随机编号后构建虚拟三维混合池,置于5×96孔板中,将各板、各行和各列分别混合,构建所有板各行的X维行池（A,B,C,……G,H）和所有板各列的Y维混合池（1,2,3,……11,12）,各板所有样本混合的Z维混合池（I,II,III,IV,V）。利用三维交叉唯一性原理与PCR检测的灵敏性与特异性,高效定性筛查样本中的阳性个体。将浓度为500 ng•µL-1的阳性对照分别用ddH2O和同浓度阴性DNA模板进行96倍（96×）稀释,检测该方法的灵敏性与特异性。5×96孔板480个样本中,双盲法随机掺入13个Bt176转化事件标准样本（Cry1Ab阳性与Bt176特异引物阳性）,通过对25个混合池检测,得到候选阳性样本,并进行二次检测,筛查出真正的阳性样本。【结果】96×混合样本未影响检测的灵敏性与特异性。通过该种混合池得到可能的33个候选样本,再对33个候选样本进行二次检测,成功检测出所有与设置相符的盲样,即掺入的13个阳性样本。【结论】该方法适用于从大量的样本中用PCR方法定性筛查少量阳性样本的检测,工作量比普通单样本逐一检测的方法降低了80%左右。     

抗玉米螟基因Cry1A.301原核表达和玉米遗传转化

增强玉米品种的抗虫性是减少玉米螟为害、提高玉米产量的有效途径。通过密码子优化改造获得抗虫基因Cry1A.301,构建原核表达载体pET30a-Cry1A.301,进行蛋白免疫学、ELISA检测以及玉米螟抗性生测。结果表明,原核表达载体中Cry1A.301蛋白高效表达,且7d后杀虫效率达100%。通过Cry1A.301基因与植物表达载体CPB连接,构建CPB-35S∶∶Cry1A.301-35S∶∶bar载体进行农杆菌介导的玉米萌动胚遗传转化,得到12株T0代转基因植株。T0代植株叶片中目的基因、筛选标记bar基因的PCR检测与蛋白免疫学检测结果表明,Cry1A.301基因已经整合到玉米基因组并表达。     

玉米穗位高全基因组关联分析及其候选基因预测

利用41 101个SNP标记对159份我国玉米自交系进行全基因组分析.通过控制群体结构和亲缘关系,采取混合线性模型,检测到7个与穗位高显著相关SNP(P ＜0.0001),并确定7个候选基因,其注释功能有GABA-B受体活性、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶活性、转运活性、翻译起始因子活性和酰胺基tRNA水解酶活性.利用BioMercator2-1软件将收集的137个稳位高QTL整合至IBM2 2008Neighbors玉米遗传图谱上,确定19个“一致性”QTL,结合分析7个与穗位高显著相关的SNP位点信息,获得2个候选基因.     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。