盐度骤降对菲律宾蛤仔抗氧化酶活力及组织结构的影响

为了探明菲律宾蛤仔在盐度骤降条件下的生理学反应及组织结构变化。本研究以盐度35‰培育的蛤仔为对照,研究了盐度骤降至25‰和15‰条件下2、6、12、24、36、48、60 h时蛤仔血淋巴中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)活力的变化。结果显示：在60 h内,对照组蛤仔3种抗氧化酶活力均呈现出较稳定的状态。相对来说,盐度25‰和15‰组蛤仔SOD和GSH-PX呈现出“显著升高-显著下降-逐步恢复”的趋势。其中盐度为25‰时,蛤仔SOD酶活力在48 h内持续显著升高,之后下降;盐度15‰时蛤仔在最初的12 h内SOD酶活力显著升高,之后显著下降;GSH-PX酶活力在2个低盐度组蛤仔中升高和降低持续的时间相当;2个低盐组蛤仔CAT酶活力在6 h时出现小幅升高后呈现整体下降趋势。3种抗氧化酶活力在实验结束时均恢复至对照组水平,说明3种抗氧化酶在盐度变化条件下会呈现规律性变化,但蛤仔适应和调整能力较强。对各盐度处理组蛤仔每天取样进行组织切片观察,仅盐度15‰组蛤仔在处理6天时出现较明显变化,体现在：鳃丝排列不规则、鳃丝间连接被破坏、鳃表面无法形成褶皱;肝胰腺细胞细胞质不饱满、腺泡腔扩大出现了部分细胞解体的现象;水管和外套膜的主要变化体现在褶皱降低或减少、上皮细胞高度降低、黏液细胞增多。该研究结果为蛤仔适应盐度骤变的生理生态学机理研究奠定了生物学基础。     

仿刺参EGFR基因的克隆与表达分析

表皮生长因子受体(EGFR)是多种细胞因子的受体,在细胞增殖、迁移及分化中具有重要的作用。应用RACE法首次从仿刺参体腔细胞中克隆出EGFR基因的全长cDNA序列。该cDNA全长3 826 bp,包括821 bp的5’-UTR,281 bp的3’-UTR,开放阅读框2 724 bp,编码907个氨基酸。推导的氨基酸序列55-184aa和365-487aa符合EGFR基因所具有的L1和L2受体结构域,在203-344aa和503-823aa含有EGFR家族特征区域CR1和CR2半胱氨酸富集区,并同为跨膜糖蛋白,在结构上具有一致性。经BlastP与GenBank已知物种氨基酸序列进行同源性比对,仿刺参EGFR基因氨基酸序列与果蝇EGFR相似性为49%,同源性为34%,与斑马鱼EGFR相似性为47%,同源性为34%,与淡水椎实螺EGFR相似性为49%,同源性为31%。据此推断,仿刺参EGFR基因属于EGFR家族成员。利用Real-time PCR技术检测了该基因在仿刺参各组织中的表达,结果显示在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中EGFR均有表达,且体腔细胞和表皮表达量较高。结果表明,该基因可能在仿刺参组织发育和再生过程中起到重要的调控作用。     

中间球海胆生长分化相关的AFLP标记

从同一遗传背景、同环境下培养的1龄中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)中,分别选择大个体50只、小个体30只,分别组成大小2组海胆,两组之间壳径、壳高2个指标均存在显著差异。共选用6对AFLP引物组合对2组海胆进行PCR扩增,发现43个标记在大小2组海胆间存在显著的频率差异(P0.05),其中29个位点差异极显著(P0.01)。所有存在显著频率差异的位点中,2个位点在大海胆组中缺失,4个位点在小海胆组中缺失,14个位点在大海胆组中出现的频率显著高于小海胆组(P0.05),而23个位点在小海胆组中出现的频率高于大海胆组(P0.05)。这一系列谱带可能与中间球海胆生长性状之间存在一定的相关关系。遗传多样性分析结果表明,大海胆组的平均Shannon氏指数、Nei氏杂合度2个指标均显著高于小海胆组(P0.05),提示杂种优势可能与中间球海胆的快速生长存在一定联系。     

达氏鳇总DNA提取初探

本文报道了我国特有珍稀鲟科鱼类达氏鳇总DNA的提取方法,并对所得的DNA样品做了电泳、紫外分光光度计检测分析,检测结果表明这是一种简便可行的DNA提取方法,且能够最大限度地减轻对鱼体的伤害。     

海湾扇贝杂交后代的微卫星鉴定

海湾扇贝(Argopecten irradians)是典型的雌雄同体型贝类,行体外受精,因此杂交育种过程中存在非目标配子污染的问题。本研究筛选10对多态性微卫星引物对海湾扇贝两个亲本及正反交两个F1子代群体各100个个体进行了分析。基因型分析结果表明,所有后代等位基因均来源于双亲,不存在外源等位基因污染情况。卡方检验表明,杂交后代基因型比例符合孟德尔遗传分离比,即微卫星标记符合孟德尔遗传。其中对AIMS026扩增位点的分析结果表明,杂交后代基因型均为双亲互补型,没有出现自交后代基因型,即杂交过程中没有自身配子的污染。该研究证实了微卫星在海湾扇贝中分离的孟德尔遗传规律,同时验证了海湾扇贝杂交过程中一系列避免异源配子污染方法的有效性,为海湾扇贝定向杂交配子隔离的可靠性提供了分子生物学证据。     

刺参26S蛋白酶体S7亚基基因的克隆与组织表达分析

应用RACE法从刺参Apostichopus japonicus体腔细胞中克隆出26S蛋白酶体组成19S亚复合体亚基之一的S7亚基基因(GenBank登录号:JQ922514)。该基因的cDNA序列全长为2 445 bp,其中5’UTR为70bp,3’UTR为1 070 bp,开放阅读框为1 305 bp,编码435个氨基酸;保守区具有典型的ATP结合和水解基序,氨基酸序列分别为GPPGTGKT和DEID,具有MAT和VRPGRLDR的RNA/DNA螺旋酶的特征性基序;刺参26S蛋白酶体S7亚基基因与紫海胆的氨基酸序列同源性最高(95%),与脊椎动物、节肢动物的同源性较高(88%~89%),与线虫、拟南芥和酵母同源性较低(85%、77%和73%);S7亚基编码的蛋白没有信号肽,也没有跨膜结构域,为非跨膜蛋白,定位于细胞中的液态基质中。采用实时定量PCR方法检测了26S蛋白酶体S7亚基基因在刺参5种组织中的表达情况,结果显示,在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中26S蛋白酶体S7基因均有明显表达,且体腔细胞中表达量最高,其次是纵肌和肠,在体壁和呼吸树中表达量较低。本研究中首次在刺参体内发现并克隆了26S蛋白酶体S7亚基基因,同时采用Realtime PCR技术对该基因的表达部位进行了研究,所得结果将为研究棘皮动物蛋白质代谢途径提供新的着眼点,为刺参生理功能的调控研究奠定了基础。     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

中间球海胆性别性状的微卫星分析

针对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius育苗生产中很难进行活体性别鉴定这一特点,采用组织切片法和微卫星标记分析法对海胆进行观察分析。试验用样品由大连太平洋海珍品有限公司提供,共31只。采用组织切片法鉴别雌、雄个体,发现17只个体为雌性,14只个体为雄性。同时,将31只个体分为雌、雄两个群体,提取性腺组织基因组DNA,利用已经筛选好的11对引物对雌、雄两个群体进行微卫星分析。结果表明,两个群体的遗传多样性没有显著差异;发现INST09-A,INST10-A,INST10-B三个等位基因的频率在两个群体间存在极显著差异(P<0.01),位点INST10在雌、雄两个群体中的基因型频率存在极显著差异(P<0.01)。初步说明这些位点及相应等位基因可能与性别决定位点存在一定的连锁关系。     

生长因子和激素对大菱鲆细胞生长的影响

研究了不同浓度生长因子、激素和条件培养基对大菱鲆Scophthatmus maximus鳍、鳃和肾组织原代培养细胞生长和增殖的影响。结果表明：当氢化可的松（HC）浓度为0.4μg/mL时,鳍、鳃组织贴壁率和迁出率最高,分别为89.4%、53.3%和92.3%、59.6%,浓度为0.8μg/mL时,肾细胞的增殖量最大;当表皮生长因子（EGF）浓度为10 ng/mL时,鳍、鳃组织块的贴壁率和迁出率均达到最高,分别为85.9%、54.6%和88.1%、56.8%,肾细胞的增殖量最大;当胰岛素（Ins）浓度为5μg/mL时,鳍、鳃组织块的贴壁率和迁出率均达到最高,分别为90.8%、52.3%和92.3%、54.2%,肾细胞的增殖量也达到最大值;当sp2/0条件培养基的添加比例为1/5时,鳍和鳃组织块的贴壁率均达到最高（96.8%和92.8%）,鳃的迁出率最高,为59.3%,肾细胞的增殖量最大;sp2/0条件培养基比例为1/4时,鳍的迁出率最高（52.3%）。     

抑制性消减杂交技术在水产无脊椎动物中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是近年来兴起的一种分离、克隆差异基因的新技术。系统阐述了该技术的原理和优缺点,综述了该技术在水产无脊椎动物差异表达基因筛选方面应用的研究进展,并对该领域面临的问题进行剖析。