仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

仿刺参ghitm基因的克隆及LPS诱导后的表达分析

根据GenBank中登录的仿刺参Apostichopus japonicus ghitm基因的EST片段,采用RACE扩增法克隆了仿刺参ghitm基因的cDNA全长序列,并利用qRT-PCR技术检测了经LPS诱导后仿刺参ghitm的表达变化情况。结果表明：仿刺参ghitm基因( Aj-ghitm)的cDNA序列全长为1325 bp,包含一个1005 bp编码334个氨基酸的开放阅读框,序列两端分别为140 bp的5’UTR和180 bp的3’UTR。序列分析结果显示, Aj-ghitm编码的蛋白含有一个8次跨膜结构域,与GenBank中登录的紫色球海胆GHITM蛋白的氨基酸序列相似度为65·4%,且在系统发育树中聚为一支; qRT-PCR检测结果表明,经LPS刺激可诱导仿刺参体腔细胞Aj-ghitm mRNA的表达且呈先下降后升高最后回复到接近正常水平的趋势,在24 h时上升到最高,随后下降。本研究是有关棘皮动物ghitm基因的首次报道,其结果可为进一步探讨ghitm在仿刺参抗细菌感染以及生长发育等方面的功能及作用机制提供参考。     

仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析

仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国北方沿海重要养殖品种之一。克隆了仿刺参profilin基因全长cDNA序列,并分析了基因的表达规律。该基因cDNA序列全长787 bp,5′-非翻译区（5′-untranslated region,UTR）长205 bp,3′-UTR长204 bp,开放阅读框378 bp,编码125个氨基酸,预测蛋白分子量13.4 kDa。仿刺参Profilin蛋白的PROF保守结构域中含有肌动蛋白互作位点、多聚脯氨酸结合位点和PIP2互作位点。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Profilin与丝盘虫（Trichoplax adhaerens）和囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii）相似度最高,为46%。Quantitative real-time PCR结果显示,profilin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参11个发育阶段及幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均有表达;在仿刺参的不同发育阶段中,未受精卵至原肠期profilin mRNA表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量增高;在仿刺参的不同组织中,profilin mRNA在体腔细胞中的表达量最高。经过棘皮动物免疫系统有效激活物脂多糖LPS的刺激,体腔细胞中profilin mRNA表达量显著升高,为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。     

棉铃虫蛋白酶体β5基因Habeta5的克隆与序列分析

[目的]运用分子生物学技术克隆棉铃虫蛋白酶体B5亚基新基因,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]以棉铃虫中肠总RNA为模扳,利用快速扩增cDNA末端（RACE）技术克隆棉铃虫蛋白酶体B5亚基新基因的cDNA序列并对所获序列进行分析。[结果]成功克隆了棉铃虫蛋白酶体瞄亚基全长947bp的cDNA序列,命名为Habeta5,包含1个843bp的完整开放读码框（ORF）序列,编码蛋白质为280个氨基酸残基,预测分子量为30．87kD,等电点为6．53。Habeta5蛋白在74～261氨基酸残基位置为蛋白酶体B5亚基的保守区域。Clustal W进行多序列比对发现,Habeta5蛋白质与果蝇等昆虫蛋白酶体B5具有62％以上的同源性,蛋白酶体B5的保守区域高度一致。邻近法NJ分子进化分析也显示,Habeta5蛋白质与其他生物蛋白酶体茚进化上同源。[结论]序列分析比对的结果表明所克隆的基因为棉铃虫蛋白酶体B5亚基基因（GenBank登陆号：FJ358434）。     

刺参4个功能基因的表达分析

为研究刺参Apostichopus japonicus的生长发育,采用实时定量PCR方法,对刺参腱生蛋白基因、胶原蛋白α2基因、整合蛋白αV基因和整合蛋白βL基因等4个候选功能基因不同月龄的组织表达进行了分析。结果表明:刺参12、13、14月龄时,腱生蛋白基因在刺参肠、管足、呼吸树、皮肤、体壁、体腔液细胞、疣足和纵肌等8个组织中均有不同程度的表达,其中在体腔液细胞和呼吸树组织中的表达量较高(P0.05);胶原蛋白α2基因在刺参管足、呼吸树、体壁、疣足和纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加,其中在呼吸树组织中表达量最高,在纵肌、疣足、体壁、肠和体腔液细胞等组织中的表达量逐渐降低;整合蛋白αV基因在纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加;整合蛋白βL基因在皮肤、体壁、疣足和管足组织中的表达量较低。本研究结果为深入研究刺参这4个功能基因提供了参考。     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

传染性支气管炎病毒上海分离株S1基因克隆及遗传变异分析

对4株最新鸡传染性支气管炎病毒上海分离株的S1基因进行RT-PCR法扩增、克隆和序列测定分析。结果表明所克隆的S1基因全长约为1.63 kb,与常用IBV疫苗株和其它血清型代表株的S1基因序列及推导的氨基酸序列相比较,核苷酸序列同源性为77.4%～82.9%,氨基酸同源性为74.7%～82.6%,为研究上海地区IBV分子流行病学积累了资料。     

麦蛾气味受体OrCo基因的克隆及其表达模式分析

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了麦蛾OrCo基因全长序列,并将该基因命名为ScerOrCo。序列分析结果显示,ScerOrCo全长为1 876bp,开放阅读框长1 422bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜区。ScerOrCo基因的氨基酸序列与粘虫Mythimna separate嗅觉受体的同源性高达87%。qRT-PCR检测结果表明ScerOrCo只在麦蛾触角中特异性表达,且雌雄虫间表达量无显著差异。     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

梭梭HaACT基因片段的克隆和3’UTR序列分析

【目的】以克隆HaACT基因为出发点,为进一步分析其表达特点奠定基础。【方法】根据NCBI上已发表的藜科其他植物肌动蛋白(Actin)序列的保守区设计一对简并性引物,以梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝为材料提取总RNA,采用RT-PCR法和3’RACE技术克隆了HaACT基因部分片段及3’UTR序列。【结果】得到HaACT基因片段1 107 bp,该序列编码257个氨基酸,3’UTR序列长度为416 bp。使用NCBI和DNAMAN软件对3’UTR序列进行了同源性分析。HaACT基因3’UTR序列与CaACT基因3’UTR序列的相似性高达93%,与BvACT基因3’UTR序列相似性为92%,与GhACT基因3’UTR序列相似性最低,为86%。【结论】HaACT基因与其他植物Actin基因可能具有相似的调控机制。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因(ndhB)的克隆及同源性分析

克隆并分析绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基(NDHB)基因片段.根据GenBank上已发表的NDHB氨基酸序列,设计合成了一对简并引物,采用RT-PCR技术对绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因进行扩增,将扩增的PCR产物与pMD18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析.克隆的绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因cDNA序列长893bp,由288个氨基酸残基组成,命名为FvndhB.序列比对结果表明FvndhB与参考的8个物种的NDHB在核酸水平上表现出较高的同源性,其与桑树、银白杨、按树、烟草、拟南芥、银杏、台东苏铁、日本柳杉NDHB核苷酸序列同源性分别为84.32%、83.88%、83.43%、82.86%、82.18%、78.82%、77.07%、71.23%.利用DNAMAN软件构建的系统进化树显示绒毛白蜡与其他植物亲缘关系较远.成功获得了绒毛白蜡FvndhB基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步克隆绒毛白蜡FvndhB全长基因及分析其表达特性奠定了基础.     

刺参Y-box基因的克隆与表达分析

为了探究Y-box基因在刺参Apostichopus japonicus胚胎发育及性别分化中的作用,根据已有的EST序列,通过RACE技术克隆了刺参Y-box基因的cDNA全长序列,并利用实时定量PCR技术进行了表达模式分析。结果表明:刺参Y-box基因cDNA全长为1 142 bp,5’端UTR为102 bp,3’端UTR为215 bp,开放阅读框(ORF)为825 bp;Y-box基因cDNA全长编码274个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白的相对分子质量为31 100,理论等电点为9.46,是亲水性蛋白;刺参Y-box氨基酸序列包含氨基酸N末端结构域、C末端结构域和冷休克结构域(CSD),其中CSD区在Y-box结合蛋白家族中非常保守;刺参Y-box结合蛋白质的二级结构没有α-螺旋和β-折叠,无规则卷曲占87.23%,延伸链占12.77%;刺参与其他物种的Ybox氨基酸的相似度为27%~41%,在冷休克区相似度很高,达到75%以上;构建的系统进化树表明,刺参与加州海兔Aplysia californica、栉孔扇贝Chlamys farreri、玻璃海鞘Ciona intestinalis聚为一支,为海洋无脊椎动物;经实时定量PCR检测,Y-box基因在小耳幼体中表达水平最高,且显著高于其他各发育阶段(P<0.05),在雄性性腺中的表达量显著高于雌性性腺(P<0.05)。研究表明,Y-box基因在刺参的胚胎发育及性别分化中发挥重要作用。     

鸡传染性支气管炎病毒河南分离株S1基因克隆及遗传变异分析

根据GenBank中已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因,设计并合成了1对引物,采用RT-PCR技术扩增鸡传染性支气管炎病毒河南分离株(HN0501)S1基因,并进行克隆和测序.结果表明,所克隆的片段大小为1739 bp,包含S1基因和部分S2基因,S蛋白切割识别位点序列为RRSRR.序列比较分析发现,IBV HN0501株S1基因与澳大利亚N1株、吉林JAAS株S1基因核苷酸同源性分别为99.6%,99.8%,氨基酸同源性均为99.3%,而与其它支气管炎病毒株核苷酸同源性为66.4%~85.2%.通过IBV S1基因系统进化分析,结果发现HN0501株与N1株、JAAS株的亲缘关系近,而与其它支气管炎病毒株的亲缘关系均较远.进一步证实IBVHN0501株为IBV肾型株.     

珍珠龙胆石斑鱼紧密连接蛋白基因Claudin-3与Claudin-12的克隆及精氨酸干预下的肠道表达

为评价Claudin-3与Claudin-12基因在珍珠龙胆石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂生长和肠道黏膜屏障中的作用,通过同源克隆及RACE PCR技术克隆珍珠龙胆石斑鱼Claudin-3和Claudin-12基因的全长,采用qRT-PCR技术分析Claudin-3和Claudin-12基因在珍珠龙胆石斑鱼脑、鳃、皮肤、肌肉、肝脏、胃、前肠、中肠、后肠、头肾、体肾、脾和心脏13种组织的表达情况,并通过饲料精氨酸干预评估上述两个基因在肠道的表达情况。结果表明：Claudin-3 cDNA全长序列为1 544 bp,包括一个153 bp的5′末端非翻译区(UTR)和743 bp的3′UTR,Claudin-3的开放阅读框(ORF)为648 bp,可编码215个氨基酸的蛋白,预测该蛋白相对分子质量为23 100;Claudin-12 cDNA全长序列为1 236 bp,包括一个118 bp的5′UTR和92 bp的3′UTR,Claudin-12的ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸的蛋白,预测该蛋白相对分子质量为37 400;系统进化树和氨基酸序列比对显示,珍珠龙胆石斑鱼Claudin-3与斜带石斑鱼亲缘关系最近,同源性最高,一致性高达98.14%,珍珠龙胆石斑鱼Claudin-12与的亲缘关系最近,同源性最高,一致性高达91.75%;Claudin-3和Claudin-12基因在被检测的13种组织中均有表达,Claudin-3 mRNA在鳃和体肾中表达量最高(P<0.05),其次是中肠和肝脏,Claudin-12在脑中表达量最高(P<0.05),其次是中肠和后肠;饲料中精氨酸含量为3.06%时,珍珠龙胆石斑鱼增重率及肠道Claudin-3和Claudin-12基因表达水平显著高于1.96%和3.74%精氨酸组(P<0.05)。研究表明,Claudin-3和Claudin-12基因表达在适宜精氨酸水平的影响下上调,可维护石斑鱼肠道黏膜屏障完整,并促进鱼体生长。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

大白菜PHK4基因cDNA3′端序列的克隆及分析

采用3′RACEcDNA末端扩增技术,克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。该序列长810bp,其中编码区序列546bp．编码181个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与拟南芥爿HK4基因的同源性分别为90％和96％．说明PHK4基因与AHK4基因编码区的同源性较高,而PHK4基因3′UTR区与AHK4基因3′UTR区的同源性为52％,远低于编码区。     

山羊DAZL基因的克隆及在山羊骨髓间充质干细胞中的表达

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇（Drosophila melanogaster）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（AAN09371）氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列．家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶（bmga pdh）基因长1485 bp（NO：DQ202316）,包括5′UTR 221 bp,3′UTR 265 bp和完整的999 bp ORF框,编码333个氨基酸残基．用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91％,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71％．bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包含3个外显子．3′UTR序列包含AATAA终止信号和Poly（A）．推导的氨基酸序列N端包含与NAD^＋结合的保守结构域：ASCTTNCL．     

鸡肾型IBV分离鉴定及S1基因序列分析

2008年从河南省某肉用鸡场疑似感染肾型IB的病鸡中分离到1株IBV,对该分离毒株进行鸡胚矮小化试验、动物同归试验和m清学鉴定,试验结果表明分离株HeNan10/08为肾型IBV.采用RT-PCR技术扩增分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析.结果表明,分离株HeNan10/08与BJ株S1基因的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.9%,推导氨基酸序列同源性为100.0%;与M41的同源性最低,核苷酸序列为78.7%,推导氨基酸序列同源性为79.0%.