鲢微卫星标记研制及其在鲢和鳙遗传多样性研究中的应用

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichys nobilis)是中国特有的四大家鱼中2个重要成员,主要分布于黑龙江、长江和珠江水系.传统人工养殖依靠天然鱼苗.但是,人口增长和人类经济活动加剧使其天然产卵和孵化场消失或遭到破坏.人工育苗技术虽然解决了鱼苗供应问题,但由于遗传资源管理和使用方法的不完善,使两种鱼的生长表现、抗病抗逆性和遗传多样性等都有明显的降低.另外,因洪水导致的养殖个体逃逸也使天然群体的遗传多样性受到干扰.近年来,比较大规模的人工鱼苗放流实践也加剧了对天然群体遗传多样性的扰动.对这些问题的深入研究迫切需要一套适用的分子标记.为评价鲢和鳙的遗传多样性、确定它们的遗传分化和地理分化、科学合理地管理和开发利用遗传资源,本研究构建了富集GT微卫星序列的基因组短片段文库.随机选择并测序的97个克隆中有87个含有微卫星序列.根据其中的21条序列,设计了22对微卫星标记引物并用来分析了在长江荆州段捕获的32尾野生鲢和7尾野生鳙的遗传多样性.所有标记引物在两种鱼中通用.在全部样品中共发现129个等位基因.每位点等位基因数在3～10个,平均5.9个.不同标记揭示的遗传多样性指数在0.33～2.00,平均1.22.由于使用的鱼个体数少,如鳙,只有7个个体,样品也只来源于长江荆州江段.本研究无法基于两种鱼的天然分布,对两种鱼的遗传分化、地理种群多样性比较、养殖群体和天然群体差异等问题进行深入分析.但是,这组标记的研制将有助于这2个中国特有经济鱼种的遗传多样性分析、遗传资源的管理及开发利用等相关研究.本研究中,微卫星DNA标记的研制使用了固定有微卫星核心序列的磁珠.这样的磁珠与两端接有已知序列的DNA片段杂交能富集出含有微卫星核心序列的片段.通过扩增和连接转化,可方便地获得大量含微卫星核心序列的片段.与已有的方法不同的是,本研究用AFLP方法的某些步骤使片段两端加上已知引物序列,方便易行.迄今,这两种鱼还没有微卫星标记连锁图谱.构建这样的图谱是本项目研究的长远目标.     

鄱阳湖通江水道越冬时期鱼类群落的栖息地适宜性分析

鄱阳湖通江水道是多种洄游性鱼类完成生活史过程的重要通道, 具有重要的生态功能, 对于长江中下游鱼类资源的养护及其多样性维持至关重要。为了解越冬时期鄱阳湖通江水道中不同体长鱼类资源的空间分布规律及栖息生境状况, 本研究将鱼类声学探测、生境遥感定量制图分析和三维水动力模拟相结合, 分别绘制出 3 种不同体长鱼类群落的水深(SI_D)、流速(SI_V)、坡度(SI_S)等单因子生境适宜度指数曲线, 并利用乘积法建立栖息地适宜性指数(habitat suitability index, HSI)模型, 对通江水道中不同水域的鱼类生境适宜度进行对比和评估。结果表明, 鄱阳湖通江水道越冬时期鱼类平均全长为(10.1±5.73) cm, 主要分布在屏峰山以北的湖口县、鞋山和屏峰附近 3 个水域; 小体长鱼类群组(1~20 cm)水深的生境适宜度曲线为双峰型, 最适宜水深包括 3.06~4.59 m 和 9.18~12.24 m 两个区间, 流速为 0.05~0.13 m/s, 坡度为 0~2.23°; 中等体长组(20~40 cm)及大体长组(＞40 cm)鱼类适宜的水深、流速和坡度的生境适宜度曲线均为单峰型, 其中中等体长组最适宜栖息的生境因子范围为水深 9.18~13.77 m、流速 0.05~0.13 m/s 和坡度 0~2.23°, 大体长组为 13.77~15.3 m、0.10~0.13 m/s 和 0~2.23°。     

湘西盲高原鳅遗传多样性的微卫星分析

利用筛选的16对微卫星标记对来自于湖南湘西龙山县乌龙山3个不同洞穴的盲高原鳅群体进行遗传多样性及遗传分化分析.通过计算多态信息含量、平均杂合度、等位基因数、遗传距离、基因流、F-统计量等参数,评估各盲高原鳅群体遗传多样性和各群体间遗传分化.16个微卫星标记在3个群体中共检测出83个等位基因.每个座位检测到3～8个等位基因不等.3个群体各个多态位点的平均观测杂合度分别为0.362 5～0.946 5,平均期望杂合度为0.538 6～0.906 5.3个群体多态微卫星位点的PIC分别为0.263 2、0.231 3、0.303 5,选取的16个微卫星位点中2个为高度多态,2个为低度多态,其余为中度多态.分子变异方差分析(AMOVA)结果表明,遗传变异大部分(92.84％)来自群体内,仅有7.16％的变异来自于群体间,数据表明3个群体处于未分化状态,遗传一致性较大.     

鲢补体C7基因的克隆、表达和序列分析

补体系统经活化形成末端补体复合物,C7是将此复合物与目的细胞的细胞膜结合的重要分子。本研究从已有的cDNA文库中克隆鲢(Hypophthalmichthys molitrix)补体C7的cDNA,其全长2 625 bp,编码821个氨基酸。同源性分析表明,鲢补体C7与草鲤鱼的氨基酸序列相同率最高(为93%)。与已报道的硬骨鱼类补体C7相同,鲢补体C7具有一些保守的结构,如TSP1、LDLRa、MACPF、EGF、TSP1、CCP。对12尾鲢补体C7进行遗传多样性分析发现有6个突变位点,其中5个是同义突变,另外一个是非同义突变,确定6个等位基因。在鲢正常组织和嗜水气单胞菌感染的免疫器官组织中,对C7基因进行了RT-PCR表达分析,结果显示,正常状态下,鲢补体C7基因只在脾中表达,在感染嗜水气单胞菌12 h后,鲢C7基因在脑、鳃、心、肾、肝、肠、脾7种组织中迅速表达,随着病原的清除,补体C7基因表达量也逐渐降低直至停止表达,说明补体C7是一个与抗嗜水气单胞菌感染相关的基因。     

基于Mi-Seq高通量测序分析裸体异鳔鳅鮀微卫星组成

利用Mi-Seq高通量测序法,分析长江上游特有鱼类裸体异鳔鳅鮀(Xenophysogobio nudicorpa)的基因组微卫星序列,观察其微卫星的组成及其特征。结果显示:在所测得的2到5碱基微卫星重复单元中,两碱基重复所占比例最多(83.15%),其中又以AC/TG类型为主。AAT和ATC是三碱基重复单元出现频率最多的,比例分别为56.01%和13.46%,高于其他六种类型的总和。四碱基重复单元占所有微卫星序列比例的2.73%,AAAG、AAAT和AGAT三种类型出现的次数最多。五碱基重复单元中,只发现3种重复序列,并且重复次数仅在1~2次内。使用引物设计软件Primer Premier Version 5.0设计引物,选择合成50对,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,筛选出具有多态性的微卫星引物共23对。实验还对裸体异鳔鳅基因组微卫星各碱基重复单元的长度进行了分析,结果表明裸体异鳔鳅微卫星主要集中在12~20 bp的范围内,占比91.53%。分析认为,在趋同选择的压力下,重复序列有向较短序列进化的趋势。     

快速鉴定四大家鱼早期资源种类的PCR方法

根据线粒体控制区序列设计了青鱼(Mylopharyngodon piceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)物种特异的PCR引物,通过对四大家鱼受精卵的PCR扩增,种间交叉扩增,相关种类早期资源的扩增以及未知种类鱼卵的鉴定发现,所设计的引物具有很高的种类特异性,对特定种DNA具有良好的扩增效果,但是不能进行交叉扩增,对四大家鱼外的其它种类也不能扩增。实验没有出现一例假阳性或假阴性结果,说明所设计引物的种类特异性高。该方法特别适合从鱼类早期资源大量样本中准确快速鉴定四大家鱼种类。     

鱼源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS在枯草芽孢杆菌中的表达及检测

用PCR方法从枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、鱼源嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的基因组DNA和质粒pGFP-2中,分别扩增P43启动子、不含信号肽的外膜蛋白基因ompTS和不含启动子的绿色荧光蛋白基因。各PCR产物经测序、酶切、连接到大肠杆菌（Escherichia coli）-枯草芽胞杆菌穿梭载体pNW33N相应位点分别构建了穿梭表达载体pNWP43gfp和pN-WP43omp。电转枯草芽胞杆菌构建菌株BS01（pNWP43gfp）,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光;电转枯草芽胞杆菌构建菌株BS01（pNWP43omp）,表达的外膜蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,穿梭表达载体pNWP43gfp和pNWP43omp构建成功。构建的枯草芽胞杆菌在P43启动子的调控下,分别实现了绿色荧光蛋白基因和外膜蛋白基因ompTS的表达。     

雌核发育鲢RAPD指纹和蛋白质电泳研究

用２３个随机引物对雌核发育鲢子一代（普通鲢作对照）进行了ＲＡＰＤ—ＰＣＲ反应,在２３个引物中除一个引物无扩增产物外,其它均可得到１～１０条ＤＮＡ带,平均每个引物产生５３８条带。其中７个引物产生多态现象,占总引物的３１４％。多态座位达１３６８％。用Ｓｈａｎｎｏｎ指数对ＲＡＰＤ数据进行遗传多样性（Ｈｏ）分析,得出所研究样本的Ｈｏ为０１７５。用血清酯酶和血清蛋白电泳作对比时没有发现在蛋白质水平的多态现象,说明ＲＡＰＤ技术是一种比较灵敏实用的ＤＮＡ多态检测方法。以ＲＡＰＤ所得数据进行了雌核发育鲢子代和普通鲢个体间的遗传相似性与遗传距离分析,为鲢选育提供了依据。     

三峡水库生态调度对长江监利江段四大家鱼早期资源的影响

为探究生态调度对长江中游四大家鱼繁殖的影响,并了解影响家鱼产卵的关键生态水文指标的量化范围,于2013—2017年5—7月三峡水库生态调度期间在长江中游监利江段进行了鱼类早期资源调查,同时对采集到的四大家鱼卵苗与生态水文指标进行了相关性分析。结果显示,家鱼卵苗量与流量增长率呈显著正相关。每年6月下旬的生态调度,监利江段涨水持续时间为4 d及以上,流量增长率为1 600～2 833 m~3/(s·d)时,家鱼卵苗发生量较大,可占年总规模的45%以上。三峡水库生态调度涨水过程能够在一定程度上满足监利江段四大家鱼繁殖的水文需求,对减缓三峡水库运行引起的长江中游鱼类繁殖的不利影响和维持鱼类种群资源补充具有重要意义。     

败血症鲢肝与肾cDNA文库构建及MHC classⅠ的克隆与分析

采用CloneMinerTM cDNA文库构建试剂盒构建了患败血症的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肝和肾的cDNA文库.经检验,文库的滴度为1.34×107 cfu/mL,总库容为2.68×107 cfu,阳性克隆率为97.5％,平均插入片段大于1.2 kb.对80个随机挑选的克隆进行两端测序,结果显示有74个测序成功.经在GenBank上BLAST比对,其中57个为已知功能基因,属于45个不同基因,另外17个没有明显的同源序列.在已知功能的57个克隆中,含有全长编码区序列的克隆共有49个,全长cDNA比率为61.25％.采用PCR法对文库进行筛选,获得一个含MHC classⅠ完整编码区的序列,该序列具有典型的脊椎动物MHC class Ⅰ的序列特征.本研究完成鲢肝和肾较高质量的cDNA文库的构建,旨在为今后开展鲢功能基因研究奠定基础.