甘蔗基因组DNA简单和快速提取方法

目前国内外关于提取DNA的方法很多(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，但因研究的对象和目的不同而有所差异。甘蔗含有大量的酚和多糖等有机物质，由于这些物质的干扰，按照常规提取植物组织总DNA的方法提取甘蔗基因组DNA，常常因产量小和纯度低而不能满足实验要求。本实验在前人研究的基础上(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，对所用药品及技术进行改进，摸索出一套快速、简便且可获得高质量基因组DNA的改良方法。用此方法提取的DNA进行酶切、RAPD和Southem杂交分析，都取得了良好的效果。     

甘蔗富含甘氨酸蛋白基因(Sc-GRP)的克隆及其表达分析

本研究在对甘蔗(Saccharum officinarum)叶片全长cDNA文库测序的基础上,通过EST (expressedsequence tag)序列测定和生物信息学分析,获得了1个编码富含甘氨酸蛋白(glycine-rich protein,GRP)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-GRP.生物信息学分析表明,该基因全长518bp,包含一个273bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),5'端非编码区(untranslated region,UTR)长58bp,3’端UTR长187bp,且在3’端UTR中有典型的加尾信号AATAAA和polyA结构.该基因编码长度为90个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10.12kD,等电点为5.86.Sc-GRP中甘氨酸含量最高,达到13％,且包含明显的GGX和GX重复结构单元.Sc-GRP没有信号肽和RNA结合位点.定量PCR分析结果表明,该基因在成熟叶片中的表达量远高于其在心叶中的表达量.在甘蔗茎中,随着节间成熟度的增加,其表达量逐渐升高,但在成熟根中几乎没有表达.在铝盐胁迫下,该基因在甘蔗初生根中的表达先是升高,然后随胁迫时间的增加而下降.研究结果提示该基因定位于细胞质,参与细胞的渗透调节,本研究结果为该基因的功能解析及其在甘蔗分子育种上的应用积累了基础资料.     

转ScMV-CP基因甘蔗的分子生物学分析与鉴定

采用改良的CTAB方法提取转基因甘蔗幼苗的基因组DNA,核酸蛋白测定仪分析及凝胶电泳结果表明,提取的DNA具有典型的DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,DNA产量为45～60μg／100mg。同时根据质粒载体设计合成了2对引物,分别扩增新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因和甘蔗花叶病毒外壳蛋白(ScMV-CP)基因。PCR检测结果表明,在53株待检测的样品中有24株同时含有这2种转基因成分,其中13株在Southern杂交中有杂交信号出现,其拷贝数为1～3个。     

甘蔗花叶病毒(SCMV)种群结构分析

针对已公布的18个甘蔗花叶病毒(SCMV)全基因组序列,利用MEGA 5.1分析了其11个蛋白(P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、Nib、CP-C和多聚蛋白)编码基因所受的选择压,并结合其编码蛋白的功能,预测了部分基因在SCMV进化过程中的角色和变异位点.结果显示:P1和CP-N端的变异性程度较大,P1蛋白多样性最高;CP-C端变异性和多样性均较低;PIPO受到的选择压最小,但多样性最低,可能是由于PIPO与P3共用一段编码序列.来源于甘蔗的SCMV多聚蛋白的第2 853、2 897和2 904个氨基酸位点(在CP中部)分别为T、R和E,而来源于玉米的SCMV多聚蛋白对应的氨基酸位点分别为S、K和D,表明这3个位点具有寄主依赖性.     

斑茅20S蛋白酶体α亚基5基因的克隆与序列分析

进行了甘蔗属近缘野生种——斑茅抗逆性基因克隆的研究。以斑茅为材料,用RACE技术克隆了斑茅的20S蛋白酶体α亚基5基因,其编码区为711 bp,编码237个氨基酸,并于genbank分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性,用Clustalx version 1.8软件分析其系统进化关系。结果表明,物种间蛋白酶体进化保守,其核苷酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的相应基因同源性分别为91％、81％、80％;其氨基酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的同源性分别达97％、95％、86％,与人的同源性也高达69％。      

35S启动子定量PCR非同源竞争模板的构建

利用35S启动子特异引物,以大肠杆菌基因组DNA为异源模板,经低严谨度PCR扩增并回收克隆适宜DNA片段,构建了35S启动子的非同源竞争对照。测序结果表明,该片段与35S启动子相应序列即靶序列除两端引物序列完全相同外,其他部分没有同源性。利用该非同源竞争对照,建立了转基因玉米35S启动子的QC-PCR技术体系,并进行了校正。     

甘蔗类泛素蛋白UBL5应答SCMV侵染及其与SCMV-6K2的互作

泛素化修饰在蛋白功能调控、生长发育和逆境应答中具有重要作用。类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins,UBLs)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的重要组分。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharumspp.hybrid)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6K2互作的类泛素蛋白UBL5,命名为Sc UBL5,长度为73aa。本研究利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步证实了Sc UBL5与SCMV-6K2互作;生物信息学分析表明, Sc UBL5为稳定的亲水性非分泌蛋白,无信号肽和跨膜结构。系统进化树分析表明, Sc UBL5具有明显的种属特异性。亚细胞定位分析表明,Sc UBL5定位于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,Sc UBL5基因的表达具有明显的组织特异性,在完成形态建成的正一叶、第7叶、根和第8节间...