基因芯片扫描中PM T信号增益与信噪比

用Cy3标记DNA片段,打印在聚赖氨酸包被的载玻片上,制作DNA芯片.在不同的光电耦合装置(photoelectric mu lti-p lication tube,PMT)电压下对DNA芯片进行扫描,研究PTM信号增益与信噪比之间的关系.结果表明,PTM信号增益仅在一定范围内与信噪比呈正相关.     

转ScMV-CP基因甘蔗的分子生物学分析与鉴定

采用改良的CTAB方法提取转基因甘蔗幼苗的基因组DNA,核酸蛋白测定仪分析及凝胶电泳结果表明,提取的DNA具有典型的DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,DNA产量为45～60μg／100mg。同时根据质粒载体设计合成了2对引物,分别扩增新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因和甘蔗花叶病毒外壳蛋白(ScMV-CP)基因。PCR检测结果表明,在53株待检测的样品中有24株同时含有这2种转基因成分,其中13株在Southern杂交中有杂交信号出现,其拷贝数为1～3个。     

甘蔗基因组DNA简单和快速提取方法

目前国内外关于提取DNA的方法很多(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，但因研究的对象和目的不同而有所差异。甘蔗含有大量的酚和多糖等有机物质，由于这些物质的干扰，按照常规提取植物组织总DNA的方法提取甘蔗基因组DNA，常常因产量小和纯度低而不能满足实验要求。本实验在前人研究的基础上(Honeycutt et al．，1992；顾红雅和瞿礼嘉，1998)，对所用药品及技术进行改进，摸索出一套快速、简便且可获得高质量基因组DNA的改良方法。用此方法提取的DNA进行酶切、RAPD和Southem杂交分析，都取得了良好的效果。     

甘蔗花叶病毒(SCMV)种群结构分析

针对已公布的18个甘蔗花叶病毒(SCMV)全基因组序列,利用MEGA 5.1分析了其11个蛋白(P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、Nib、CP-C和多聚蛋白)编码基因所受的选择压,并结合其编码蛋白的功能,预测了部分基因在SCMV进化过程中的角色和变异位点.结果显示:P1和CP-N端的变异性程度较大,P1蛋白多样性最高;CP-C端变异性和多样性均较低;PIPO受到的选择压最小,但多样性最低,可能是由于PIPO与P3共用一段编码序列.来源于甘蔗的SCMV多聚蛋白的第2 853、2 897和2 904个氨基酸位点(在CP中部)分别为T、R和E,而来源于玉米的SCMV多聚蛋白对应的氨基酸位点分别为S、K和D,表明这3个位点具有寄主依赖性.     

斑茅20S蛋白酶体α亚基5基因的克隆与序列分析

进行了甘蔗属近缘野生种——斑茅抗逆性基因克隆的研究。以斑茅为材料,用RACE技术克隆了斑茅的20S蛋白酶体α亚基5基因,其编码区为711 bp,编码237个氨基酸,并于genbank分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性,用Clustalx version 1.8软件分析其系统进化关系。结果表明,物种间蛋白酶体进化保守,其核苷酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的相应基因同源性分别为91％、81％、80％;其氨基酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的同源性分别达97％、95％、86％,与人的同源性也高达69％。      

甘蔗捕光叶绿素a/b 结合蛋白基因ScLhca3 的克隆及表达

捕光叶绿素a/b结合蛋白是植物光系统I (photosystem I, PSI)中与色素分子结合的膜蛋白, 由Lhca基因家族编码, 主要参与光合作用中光能的捕获与传递。本研究对甘蔗叶片cDNA文库测序, 获得甘蔗PSI中Lhca3基因的cDNA序列, 命名为ScLhca3 (GenBank登录号为KU215669)。生物信息学分析表明, ScLhca3的开放读码框(opening reading frame, ORF)长度为804 bp, 编码267个氨基酸, 分子量为28.91 kD, 等电点为8.96; ScLhca3被定位于叶绿体, 无信号肽, 存在3个明显的跨膜区域, 含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain), 为亲水性非分泌蛋白。多序列比对和进化分析表明, ScLhca3在不同物种间具有较强的保守性, 具有种属特性。构建原核表达载体pGEX-6P-1-ScLhca3, 通过IPTG诱导表明, ScLhca3蛋白与预测大小一致。亚细胞定位试验显示, ScLhca3与报告基因GFP的融合蛋白定位于叶绿体中。实时定量PCR分析表明, ScLhca3在成熟叶片中的相对表达量最高, 根中几乎不表达, 具有明显的组织特异性; 在CdCl₂、ABA和H₂O₂外源胁迫下, ScLhca3均上调表达; 在黑暗、NaCl和PEG胁迫下则下调表达。     

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。