牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础.     

鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823 bp,DPV为576 bp和DuCV为338 bp.经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法.该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL.对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6％;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56％.结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查.     

番鸭细小病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测番鸭细小病毒(MDPV)的方法,本研究根据GenBank中MDPV的REP基因序列,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测MDPV的荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法检测敏感性达到20 copies,比常规PCR灵敏度高100倍;而且该方法对鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等的检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法的批内和批间的检测变异系数均小于2%。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,其MDPV阳性率为11.02%。结果提示广西地区的鸭群中MDPV的感染比较普遍,建立的荧光定量PCR方法可以用于MDPV的临床快速检测。     

1株白鹭源新城疫病毒致病特性及全基因组序列测定分析

2011年从广西防城港市1只患病白鹭中分离到1株新城疫病毒(命名为WBE-10),为了对其主要生物学特性及基因组序列进行研究,对该毒株进行了1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)的测定和全基因组扩增(RT-PCR)。结果显示:该病毒的ICPI值为1.846,表明该毒株属于强毒株,F基因的112～117位氨基酸序列为112R-R-R-K-R-F117,符合NDV强毒株的特征,该结果与ICPI的测定结果一致;F基因绘制的遗传进化树表明该毒株属于基因VIIa型,与Sukorejo/019/10株的亲缘关系最近,该分离株在全基因组序列与印度尼西亚鸡分离株Sukorejo/019/10较接近。本试验为进一步了解候鸟源携带新城疫病毒与家禽新城疫疫病传播、暴发之间的联系提供一定的科学依据。     

鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.     

三种对虾病毒多重实时荧光PCR检测方法的建立

根据基因库中白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和桃拉综合征病毒（TSV）的基因序列,设计了WSSV 、IHHNV和TSV的三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV 、IHHNV和TSV的三重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV 、IHHNV和TSV的检测敏感性分别达到20000、20和20000个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV 、IHHNV和TSV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这三个病毒。对保存的45份经常规PCR检测仅为WSSV 、IHHNV和TSV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中2份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的三重实时荧光PCR方法用于WSSV、IHHNV和TSV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。     

奶水牛牛分枝杆菌的分离与鉴定

从患疑似结核病的广西奶水牛群中进行牛分枝杆菌的分离和鉴定。共收集了238份临床样品(鼻黏液及牛奶),病料经1.25 mol/mL NaOH溶液预处理后,接种罗氏培养基进行细菌分离。分离菌经进一步纯化后进行抗酸性染色并镜检,镜检后判为阳性的细菌再接种到鉴别培养基上进行鉴别培养,同时,应用PCR方法对镜检为阳性的细菌进行进一步的鉴别检验。结果收集的所有临床样品,经37℃培养后共获得细菌12株。这12株菌经抗酸性染色后镜检都为分枝杆菌阳性,进一步经鉴别培养基鉴定12株菌中有2株为牛分枝杆菌,其余均为非典型分枝杆菌。2株牛分枝杆菌经PCR方法鉴定得以确诊。     

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。