人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

弱光对苗期大豆叶片形态结构和光合荧光特性的影响

【目的】探究弱光环境对苗期大豆叶片形态结构及光合荧光特性的影响。【方法】采用两因素完全随机设计盆栽试验,以耐荫品种南豆12和荫蔽敏感品种桂夏3号为研究对象,设置CK(正常光照)、A1(遮光度69.7%)和A2(遮光度86.3%)3个处理,分析不同弱光处理下苗期大豆叶片的形态、解剖结构、光合色素含量和光合荧光特性的响应。【结果】与CK相比,弱光下大豆叶面积增大,比叶重、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和叶片厚度均下降,且下降幅度随遮光程度的增加而增加,南豆12叶片的栅海比先增大后减小,最大值出现在处理A1(1.36),显著高于桂夏3号。大豆叶片叶绿素a含量、净光合速率、实际量子产量在遮荫处理下均有不同程度的下降,而非光化学淬灭系数随着遮荫程度的增加呈先升高后降低趋势。对于不同品种,弱光环境下,南豆12的光合特性优于桂夏3号。在强遮荫处理A2下,南豆12叶片叶绿素含量及光合荧光参数变化幅度都小于桂夏3号,且净光合速率更高。【结论】光强直接影响到大豆叶片的形态结构及光合荧光特性,且不同耐荫性大豆品种的叶片结构和光合荧光特性对弱光环境的响应存在差异。     

小冠开心形和细型主干形‘玉露香’梨光能截获与光合作用差异

小冠开心形和细型主干形是黄土高原梨树生产中的主要树形模式。为阐述这两种树形对冠层光能截获和叶片光合功能的影响，以山西芮城县4年生的‘玉露香’梨为试材，2017年和2018年连续两年测定了冠层截获的光合有效辐射PAR、叶片光合的光响应特性、荧光淬灭动力学特性以及光午休期间叶片的热耗散特性和光呼吸。结果表明：小冠开心形冠层不同方位和不同时刻截获的PAR均高于细型主干形，平均提高47.6%；与细型主干形相比，小冠开心形叶片光响应的最大净光合速率Pnmax,p与光饱和点LSP显著升高；光合碳同化过程的3个限制因子中，磷酸丙糖利用速率Vtpu对冠层光环境变化最敏感。正午强光胁迫下，小冠开心形叶片光呼吸速率Pr与总光合速率Pg的比例（Pr/Pg）比细型主干形叶片提高58.5%，NPQ中可恢复组分r(qE)提高了8.9%，而不可恢复组分r(qI)降低了75.0%。两种树形相比，小冠开心形梨树冠层可截获更多的光能，叶片的光合能力更强，强光胁迫时能够通过更高效的热耗散和光呼吸进行自我保护，可作为黄土高原产区梨树适宜树形。     

不同光源对4种蔬菜幼苗叶绿素荧光及生理指标的影响

为了解不同光源或光源组合对茄子、辣椒、番茄、黄瓜幼苗叶绿素荧光及生理指标的影响,在4种基本光源的基础上,比较了不同光源处理下不同蔬菜植株叶片的叶绿素荧光参数、可溶性蛋白和可溶性糖含量。结果表明:红蓝光源不利于4种蔬菜幼苗叶片光合色素的形成,茄子、辣椒、番茄和黄瓜叶片中的光合色素含量分别在2白4红2黄、3白3红2黄、8黄或8红、8白光源下最高;茄子和番茄幼苗叶片在红蓝光源下,辣椒和黄瓜在3白3红2黄光源下,最大光化学效率和实际光化学效率都最大;茄子和辣椒幼苗在红蓝光源下所受非生物胁迫最小,叶片中可溶性蛋白含量最低,而番茄和黄瓜分别在3白3红2黄和8白光源下的可溶性蛋白含量最低;红蓝光源可明显增加4种蔬菜幼苗叶片的可溶性糖含量,对幼苗的形态建成有积极的影响。在冬春季蔬菜育苗生产中,可根据不同光源优势为不同种类蔬菜组配光源,以促进幼苗生长发育。     

基于荧光光谱的辣椒种子品种识别

为了提高辣椒种子品种鉴别效率,实现辣椒种子品种快速无损鉴别,研究了一种基于荧光光谱的辣椒种子品种快速无损识别方法。选择同一系列相似辣椒种子的杂交品种卓椒3号、卓椒4号和卓椒5号为研究对象,分别采集辣椒种子的荧光光谱56份,对原始光谱进行Savitzky-Golay(SG)卷积平滑和一阶导数(first derivative,FD)预处理;采用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)方法提取主成分,实现数据降维;采用Fisher判别分析方法建立辣椒种子品种识别模型。结果显示:采用荧光光谱建立判别模型时,卓椒3号辣椒种子的品种识别正确率达到92.9%,卓椒4号、卓椒5号辣椒种子的品种识别正确率均达到100.0%,整体识别正确率达到97.6%;采用荧光光谱的一阶导数光谱建立判别模型时,卓椒3号、卓椒4号、卓椒5号辣椒种子的品种识别正确率均达到100.0%,整体识别正确率达到100.0%。研究结果表明,种子叶绿素荧光光谱结合化学计量学方法能够有效识别辣椒种子品种。     

免疫层析技术及应用的研究进展

免疫层析技术是一类以纳米级标记物探针作为示踪和标记物的检测技术。此类技术除了具有操作简易、反应迅速和时耗较短等特点外,还兼具低成本和高特异性,尤其适用于临场检测。免疫层析技术的发展随着时代需求也在不断加速和更新,现以经典的胶体金免疫层析技术为基础,综述时间分辨与镧系元素荧光免疫层析、荧光微球免疫层析、量子点免疫层析、纳米模拟酶免疫层析及结合新技术的免疫层析的原理、研究进展和临床应用,并对免疫层析技术的未来发展做出展望。     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

钙营养胁迫对加工番茄幼苗营养分配及其生理指标的影响

以加工番茄87-5的幼苗为试验材料,设置Hoagland营养液钙浓度分别为0mg/L(不加钙)、160mg/L、320mg/L、640mg/L不同的钙浓度梯度胁迫处理,处理21d后测定其生长状况指标和生理指标.结果表明:不同钙浓度处理下,87-5叶片的氮磷钙含量均高于茎和根,320、640mg/L钙浓度处理下镁含量均降低,640mg/L钙浓度处理下根和茎镁浓度与对照差异显著;320mg/L钙浓度显著提高了加工番茄幼苗的根系活力,640mg/L钙浓度时叶绿素含量比对照显著降低.由此可知,钙浓度亏缺或过剩,均会影响加工番茄根系活力和各器官的钙镁元素分配,导致叶绿素合成减少.     

大豆北方茎溃疡病菌荧光RAA检测方法的建立

本文根据大豆北方茎溃疡病菌与其近似种在序列上的差异,设计了特异性的引物和探针,建立了荧光RAA特异性检测方法,并用大豆上常见的病害及其近似种进行验证。结果表明:供试的菌株,只有大豆北方茎溃疡病菌表现出阳性扩增信号,其他菌株和空白对照均未检测到荧光信号,该方法可以检测到1.0×10³ mL^-1的阳性DNA,完成整个检测只需20 min左右,可以快速、灵敏的完成进出境大豆产品的大豆北方茎溃疡病菌的检测。