红掌细菌性疫病病原菌的PCR特异性检测

 红掌细菌性疫病(Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae,简称Xad)是红掌等天南星科花卉毁灭性病害,该病通过带菌种苗调运不断在我国扩散蔓延,国内尚未有检测方法。通过筛选和重新设计引物,建立了Xad 的PCR 检测方法,结果表明,利用引物Xad-F / Xad-R 进行PCR,能扩增出检测Xad 的特异性DNA 片断,其灵敏度可达1 × 102 CFU / mL,DNA 的最低检出限为0. 44 ng / μL,可用于红掌苗的带菌检测和红掌细菌病害的鉴定。     

江西和广东烟草青枯菌对噬菌体的敏感性及聚类分析

为探索不同噬菌体对不同烟草青枯菌的侵染能力,选择从土壤中分离的6个青枯菌噬菌体,通过双层平板噬菌斑检测法,测定6个噬菌体P1521、P1553、P1556-1、P1556-2、P574-2和P7-1对江西和广东两省烟区75个烟草青枯菌的侵染和裂解情况,并基于青枯菌对3个噬菌体的敏感性差异,进一步对75个青枯菌进行聚类分析。结果表明:6个噬菌体分别可侵染65、63、61、57、57和24个烟草青枯菌菌株,噬菌体P1556-1和P1521寄主范围较广,噬菌体P1553寄主范围较窄;基于P1556-1、P574-2和P1553等3个噬菌体,对75个青枯菌进行聚类分析,将75个烟草青枯菌分为7个遗传组(Rs-I~Rs-VII),其中Rs-IV菌株数量较多,包括31个青枯菌,占供试菌株的41.33%,这些菌株对P1553噬菌体均表现不敏感,而对其它2个噬菌体敏感。     

马铃薯软腐病菌室内药剂及拮抗细菌筛选

由Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense(Pcb)引起的马铃薯细菌性软腐病是马铃薯重要病害之一,在我国马铃薯产区普遍发生,危害严重,其化学防治和生物防治研究和应用较少。以Pcb为指示菌,选择9种常用的细菌药剂,通过室内平板试验,筛选出对Pcb具有抑菌作用的4种药剂,抑菌效果依次为万胜清(20%溴菌腈·5%壬菌铜)、克菌康(3%中生菌素)、辛菌胺醋酸盐和金霉唑(1.5%噻霉酮);进一步从土壤中分离并获得对Pcb有拮抗作用的5个拮抗细菌RFjk1～RFjk5,它们分别与菠萝泛生菌(Pantoea ananatis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)及松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)的16SrDNA序列相似性在99%以上,鉴定为粘质沙雷氏菌的拮抗细菌RFjk2,显示出潜在应用前景,可望为马铃薯细菌性软腐病的化学防治和生物防治奠定基础。     

兰花主要病害鉴定及药剂筛选试验

对几种主要蕙兰病害进行了病原鉴定、生长温度选择、室内药剂筛选和田间药效试验,结果表明,引起大花蕙兰感病的3种主要病菌为兰花炭疽病菌、兰花白绢病菌、兰花黑腐病菌;兰花白绢病菌和兰花黑腐病菌的菌丝适宜生长温度范围分别是12~37℃、14~34℃,最适温度均为24~32℃;对白绢病菌、炭疽病菌、黑腐病菌抑菌效果较好的药剂分别有9种、5种和11种;菌克、甲基托布津对兰花炭疽病的田间防治效果较好,分别达88.67%和81.00%。     

赣南地区番茄青枯菌菌系多样性分析

【目的】分离鉴定赣南地区番茄青枯病菌,明确菌系分化,为当地番茄抗青枯病育种和病害防治奠定基础。【方法】从江西省赣南地区采集番茄青枯病病株,经选择性平板分离、纯化和分子鉴定,获得不同地理来源的青枯菌Ralstonia solanacearum菌株。通过生理生化测定和接种番茄试验,鉴定青枯菌的生化变种和致病类型。PCR扩增内切葡聚糖酶基因egl序列,明确青枯菌的演化型和序列变种。双层平板培养法测定其对8个不同噬菌体的敏感性。【结果】获得了来自赣南地区9个市(县)的番茄青枯菌菌株44个,其中,41个菌株为生化变种Ⅲ,3个菌株为生化变种Ⅳ;致病力测定结果聚为I、II和III类,其致病力分别为强、中和弱,其中,强致病力菌株占65.9%。所有菌株属于亚洲分支演化型(Ⅰ),并进一步划分为Sequevar13、14、15、17、18、34、44和48等8个序列变种。大部分菌株对供试的8个噬菌体敏感。【结论】赣南地区番茄青枯菌以生化变种III和强致病力菌株为主,对噬菌体较敏感,存在8个序列变种,具有明显的菌系分化现象和遗传多样性。     

水稻基腐病菌的越冬与侵染途径研究

采用抗利富平的水稻基腐病菌株REch7研究了病菌的越冬存活，侵染及病菌的存在部位，结果表明：水妥基腐病菌可在土壤，田水及病残体中存活，但主要越冬场所为病稻草及含病残体的土壤，病菌可以从受伤的根，茎和叶鞘侵入，但以根系侵入为主，植株受伤对病菌侵入非常关键；侵入后1周内，病菌主要集中于根茎基部。     

江西烤烟棒孢霉叶斑病病原菌鉴定

为了鉴定江西省吉安地区一种新的烤烟叶斑病病原菌,研究了该菌的致病性、形态特征以及温度对其生物学特征的影响,分析了其核糖体DNA-ITS 序列同源性。结果表明,该病原菌属于棒孢属真菌,同源性分析显示,该菌与 Gen Bank 中多主棒孢霉 ITS 序列的同源性达99%以上,确认该病原菌为多主棒孢霉〔Corynespora cassiicola(Berk. Curt.)Wei〕;生物学特性测定结果表明,菌丝在低于9℃、高于39℃条件下不生长,生长最适温度为26.5℃;最适于产孢温度为29℃,而分生孢子萌发最适温度为26.5℃。烤烟棒孢霉叶斑病在江西属首次报道。     

利用实时荧光PCR 方法检测香蕉软腐细菌

 由Dickeya spp.引起的香蕉细菌性软腐病是近年来在中国广东发生的一种严重危害香蕉的病 害,检测方法的建立和应用是防止病害传播和实时防治的重要手段。依据报道的Dickeya spp.通用引物, 建立了用于香蕉细菌性软腐病发病植株和带菌土壤检测的实时荧光PCR 方法。优化后的检测体系对香蕉 软腐细菌（XJ8-3-3）靶片段克隆质粒DNA 的检测灵敏度可达到2.4 × 10^-5 ng · μL^-1,对菌悬液的检测灵敏 度可达到4.0 × 10² cfu · mL^-1,而常规PCR 对其检测的灵敏度为2.4 × 10^-3 ng · μL^-1 和4.0 × 10⁴ cfu · mL^-1, 实时荧光PCR 的灵敏度比常规PCR 高100 倍。利用实时荧光PCR 能够快速的检出香蕉细菌性软腐病发 病植株和带菌土壤中的病原菌量,对梯度稀释的菌悬液接种的带菌土壤检测结果表明,可检测到病菌DNA 最低含量为0.35 pg · L^-1。该方法适用于对香蕉软腐病菌的检测和监控。     

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ~(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。