番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

南瓜MSAP 体系的优化及引物筛选

以南瓜自交系北观（Cucurbita maxima）为材料，利用正交设计L₁₆（4⁵）优化南瓜MSAP 预扩增和选择性扩增体系的主要因素。结果表明，第一步最佳酶切时间2 h，Hap Ⅱ（HpaⅡ，MspⅠ）用量0.5 μL；第二步酶切时间6 h，EcoR Ⅰ用量0.4 μL；连接体系包括酶切产物21 μL，EcoR Ⅰ接头（5 μmol · L^-1）、Hap Ⅱ接头（5 μmol · L^-1）各1.0 μL，连接时间12 h，T4 DNA Ligase 用量为0.5 μL；最佳预扩增反应体系（25 μL）包含2.0 μL 连接产物，1.5 μL 10 × PCR Buffer（Mg²⁺ plus），2.0 μL dNTP（2.5 mmol · L^-1），0.6 μL Taq 酶（5 U · μL^-1），0.4 μL 上下游引物（10 μmol · L^-1）；最佳选择性扩增反应体系为预扩增产物稀释120 倍的模板4.0 μL，其他同预扩增体系。最后，利用建立好的MSAP 体系进行6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证并筛选出适于南瓜MSAP 分析的36 对引物，表明优化后的MSAP 体系多态性好，体系稳定，可重复，为后续进行南瓜MSAP 分析奠定了基础。     

球孢白僵菌对棕榈蓟马的毒力测定

采用不同浓度的球孢白僵菌Bb050230 菌株,对棕榈蓟马成虫和若虫进行致病力测定。结果
表明：球孢白僵菌对棕榈蓟马的成虫和若虫具有较高的毒力,用浓度为3.0×10⁸ 个·mL^-1 的球孢白僵菌
孢子悬浮液接种8 d 后对棕榈蓟马成虫和若虫的累计校正死亡率分别为85.76% 和83.25%,致死中时间
（LT₅₀）最短分别为4.43 d 和4.79 d,第8 天棕榈蓟马成虫和若虫的致死中浓度（LC₅₀）分别为3.106×10⁵
个·mL^-1 和3.284×10⁵ 个·mL^-1。     

平菇细菌性褐斑病病原菌RT-PCR检测方法的建立及其应用

 平菇细菌性褐斑病是一种严重危害平菇生产的病害,早期监测和防治是关键。采用平菇细菌性褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）毒素基因的特异性引物（Pt-1A）/（Pt-1D1）,通过扩增条件优化,建立了该菌的实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction）检测及富集方法,并利用该方法完成了该菌在平菇表层的动态监测。试验结果表明,实时荧光定量PCR对托拉斯假单胞杆菌的检测范围为10² ~ 10⁹ cfu ? mL^-1,在经过选择性培养基富集后,检测灵敏度进一步提高了100倍。利用选择性培养基富集及荧光定量PCR检测方法,可在病害症状未显现之前检测到病原菌,为平菇细菌性褐斑病的流行监测和早期防治奠定了技术支持。     

诺沃霉素对西瓜立枯病的防治效果

采用室内抑菌试验和浸种盆栽试验探究诺沃霉素A 对西瓜立枯病的防治效果。室内抑菌试验结果表明，诺沃霉素A对立枯丝核菌具有强烈的抑菌活性，抑制中浓度为1.726 0 μg · mL^-1；经10 μg · mL^-1 诺沃霉素A 处理后，在显微镜和扫描电镜下观察立枯丝核菌菌丝形态均发生异常；盆栽试验结果表明，4 000 μg · mL^-1 诺沃霉素A 浸种对西瓜立枯病防效为91.83%。     

多主棒孢SdhB-H278Y突变位点real-time PCR检测体系的建立与应用

根据Gen Bank已登录序列中黄瓜多主棒孢琥珀酸脱氢酶B亚基(Sdh B)基因序列差异，针对Sdh B-H278Y突变设计特异性引物，建立Sdh B-H278Y突变实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系。结果表明：供试多主棒孢携带Sdh B-H278Y、Sdh B-I280V突变；Sdh B-H278Y突变株对啶酰菌胺抗性较强，EC₅₀值为21.47μg·m L^-1或>30μg·m L^-1；建立的real-time PCR检测体系具有良好的线性关系，相关系数R²=0.992 9，可特异性检测Sdh B-H278Y突变，灵敏度为3.6×10^-4ng·μL^-1，为AS-PCR的10倍。利用携带Sdh B-H278Y突变不同比例的基因组DNA对检测体系进行验证，预期值与检测值具有很高的相关性，R²=0.999 7；利用该检测体系对山东地区黄瓜棒孢叶斑病病斑中多主棒孢Sdh B-H278Y突变株所占比例进行检测，检测...     

辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用

根据辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）与致病疫霉菌（Phytophthora infestans）及其他8种常见土传病害病原菌Actin基因序列差异,设计并筛选出辣椒疫霉菌的特异性引物YM2F/YM2R,建立辣椒疫霉菌的实时荧光定量PCR检测体系,并利用该体系定量检测人工模拟带菌样品及田间发病土壤样品中的辣椒疫霉菌。试验结果表明,利用该引物建立的实时荧光定量PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为1 × 10-1 pg ? μL-1,是普通PCR的100倍。该体系无需病原菌的分离培养即可对土壤中的辣椒疫霉菌进行快速、特异且定量检测。对田间土壤样品的检测结果表明,在一定范围内病害发生、流行程度与病原菌密度成正比,从而为该病的流行监测和早期防控提供科学依据。     

复合涂膜结合紫外线照射对牡丹切花品质的影响

为延长牡丹（Paeonia suffruticosa）鲜切花的保鲜时间,利用聚乙烯醇、壳聚糖、柠檬酸、甘油、十二烷基硫酸钠（SDS）、纳他霉素制成复合涂膜保鲜剂,在20 ~ 25 ℃及相对湿度68% ~ 86%条件下采用高压电动喷涂工艺并结合紫外线照射技术处理‘洛阳红’牡丹切花,考察对切花品质及寿命的影响。结果表明：该方法可显著增强切花的弹性和坚韧性,较好地保持切花色泽,减少水分损失,同时抑制霉菌和酵母菌的增长。通过二次多项式逐步回归法建立各因素与瓶插寿命之间的数学方程,并得到最佳复合涂膜配方与紫外处理参数为：聚乙烯醇35 mg · mL^-1,壳聚糖21 mg · mL^-1,纳他霉素1.0 mg · mL^-1,SDS 2.1 mg · mL^-1,柠檬酸5.4 mg · mL^-1,在紫外线强度为90 μW · cm^-2、波长为253.7 nm时处理20 min。本处理方法可使牡丹鲜切花的瓶插寿命保持12 d。     

利用免疫磁性分离–PCR检测安祖花细菌性枯萎病病原菌

 根据地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae）的RAPD序列设计特异性引物,并对羧基化磁珠的结合性能进行检验,从而建立和优化了免疫磁性分离–PCR体系,对安祖花细菌性枯萎病进行早期检测。结果表明：1 mg磁珠对多克隆抗体最大吸附值为0.268 mg,进行免疫磁性捕获时免疫磁珠的最佳浓度是0.566 ~ 0.741 mg ?mL^-1。免疫磁性分离–PCR可以减少PCR反应中的抑制物质,对X. axonopodis pv. dieffenbachiae的检测灵敏度可以达到10 ~ 100 cfu ?mL^-1,比常规PCR检测灵敏至少100倍。     

番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g~(-1);检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g~(-1)。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

氰氨化钙土壤消毒对黄瓜根腐病及土壤病原菌的控制效果

应用氰氨化钙土壤消毒技术防治黄瓜根腐病,通过病害防治效果、植株生长情况等指标,结合土壤中茄病镰刀菌实时荧光定量PCR检测手段明确氰氨化钙不同剂量处理后病原菌菌量的动态变化,以此评估氰氨化钙土壤消毒防治黄瓜根腐病的施用效果。应用建立优化的荧光定量PCR检测体系监测土壤中茄病镰刀菌带菌量,最低检测量为1×101个拷贝·g~(-1)。研究结果表明,氰氨化钙最佳施药量为120 g·m~(-2),其茄病镰刀菌消毒3 d菌量大幅下降,9 d时降为0,种植黄瓜苗后菌量恢复缓慢,对黄瓜根腐病防治效果为66.56%~74.41%,植株长势良好。     

鹿角蕨的孢子培养及其繁殖

 以大型观叶植物鹿角蕨（Platycerium wallichii Hook.）为材料,采用无菌培养和常规繁殖方法,研究其孢子培养及幼苗的复壮。结果表明：孢子萌发适宜温度为20 ~ 30 ℃;在黑暗条件下孢子不萌发,孢子萌发和配子体发育最适光照强度为60 ~ 80 μmol · m^-2 · s^-1;配子体在pH 4.5 ~ 7.5的范围都可以正常发育;蔗糖浓度小于等于2%的培养条件更利于孢子的萌发及原叶体的形成。当幼孢苗发育到2 ~ 3 cm时即可移栽,移栽适宜的基质为腐殖土︰河沙︰有机肥 = 4︰2︰1;幼孢苗复壮4个月左右,株高约10 cm时即具有一定的观赏价值。     

主要果树病毒实时荧光定量PCR检测技术研究进展

综述了苹果、梨、柑橘、葡萄和香蕉病毒的实时荧光定量PCR检测技术研究进展,并对今后主要研究方向进行了讨论和展望。     

虾青素合成关键酶基因bkt 在‘Brookfield Gala’苹果中的遗传转化及表达

 虾青素是一种氧化型酮式红色类胡萝卜素,具有更强的抗光氧化能力。将β–胡萝卜素酮化酶（虾青素生物合成的关键酶）基因bkt构建入表达载体pCAMBIA1301中,获得植物表达载体p1301-bkt,转化根癌农杆菌EHA105,获得工程菌,以黄肉苹果‘Brookfield Gala’无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化。筛选压确定结果表明：‘Brookfield Gala’对潮霉素（Hyg）很敏感,叶片再生最佳Hyg选择压为3 mg · L^-1,试管苗增殖为4 mg · L^-1,生根为2 mg · L^-1;头孢霉素（Cef）浓度≤400 mg · L^-1时对叶片再生芽数的影响不明显。GUS染色、PCR和RT-PCR检测结果表明,有8株转基因植株整合bkt基因并获得了表达,其表型有红色产生;转基因植株类胡萝卜素的HPLC测定显示,虾青素和角黄素在叶片中的积累量达到2.85和1.79 μg · g^-1。本研究结果显示有望通过调控代谢途径,在苹果中合成虾青素,提高果实自身的抗光氧化能力,防止日灼。     

基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析

 以红叶石楠（Photinia fraseri）的胚性愈伤组织为受体材料,利用基因枪法导入外源抗寒基 因rd29A,以期建立基因枪转化红叶石楠的技术体系。结果表明,基因枪转化红叶石楠的最佳组合条件为： 胚性愈伤组织在诱导培养基MS + 6-BA 2.0 mg · L-1 + NAA 5.0 mg · L-1 + 2,4-D 0.5 mg · L-1 + 琼脂5.0 g · L-1 + 蔗糖20 g · L-1 里,用0.3 mol · L-1 甘露醇处理15 ~ 16 h;基因枪轰击时添加12.5 mol · L-1 氯化钙 50 μL + 0.1 mol · L-1 亚精胺50 μL,每枪含金粉300 μg + 质粒DNA 3.0 μg,轰击距离9 cm,轰击压力1 100 psi, 轰击次数1 次。经多次筛选获得了6 株转基因植株,转化植株经PCR 检测和Southern 分析,证实了rd29A 已经整合到红叶石楠基因组中。     

地衣芽孢杆菌W10及其抗菌蛋白对桃褐腐病的抑制作用

地衣芽孢杆菌菌株W10菌液及其产生的抗菌蛋白对贮藏期桃褐腐病都有较好的抑制作用,高浓度（1 × 1010 cfu · mL-1菌液,3.0 mg · mL-1抗菌蛋白）效果更好。在较低温度（4 ℃）和湿度（RH70% ~ 75%）条件下,高浓度菌液和抗菌蛋白在病菌定殖前处理桃果能收到较好的防病效果。钙离子[0.1% Ca(NO3)2]能提高W10菌液及抗菌蛋白对桃果实褐腐病的防治效果,能明显推迟始病时间。W10菌液和抗菌蛋白浸果处理能显著降低贮藏期的自然腐烂率,与多菌灵效果类似;通过对果肉色差L*值、果实硬度、可溶性固形物含量、失重率等品质指标参数的测定,发现菌液和抗菌蛋白处理均不会影响果实品质。     

白天短期不同温、光、CO_2对甜瓜幼苗叶片光合作用的影响

通过光照培养箱准确控制光温环境,对不同温度、光照强度和CO2浓度环境因子组合条件下的甜瓜苗期叶片净光合速率的连续测定,并通过单因素相关性分析温度、光照强度和CO2浓度对叶片光合作用的综合作用。结果表明:在光照强度600μmol·s-1·m-2一定的条件下,温度在12～30℃范围内,叶片净光合速率与温度呈正相关,且在30℃时达到最大值;温度在30～36℃范围内,净光合速率与温度呈负相关;固定CO2浓度为1000μL·L-1,光照强度在70～600μmol·s-1·m-2之间,净光合速率与光照强度呈正相关;在温度一定的条件下,CO2浓度在400～1600μL·L-1范围内,净光合速率与CO2浓度具有很好的正相关性。