烟草糖基转移酶sm-ngt1缺失体表达载体的构建及遗传转化

利用烟草糖基转移酶基因sm-ngt1序列的氨基端(N’-GT)和羧基端(C’-GT)的部分序列与双元载体pCAMBIA1302连接,构建了含有N’-GT、C’-GT的缺失片段与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因。通过农杆菌介导的叶盘转化法转化W38烟草,通过PCR检测发现含有目的片段的融合基因的转基因植株阳性率可达80%以上,为后续的基因功能研究奠定基础。     

籼稻品种Kasalath遗传转化条件的研究

[目的]探索籼稻品种Kasalath的遗传转化条件,为该品种进一步的分子生物学研究奠定基础。[方法]以籼稻品种Kasalath的愈伤组织为转化受体,应用根癌农杆菌介导法进行遗传转化;从共培养方式、共培养时间、共培养后处理方法等方面优化遗传转化体系。[结果]当愈伤组织与农杆菌共培养时间为2d时的转化效果最好,抗性愈伤组织获得率达84.1%,转化菌的转化率达到73%,且共培养时愈伤组织是否直接接触培养基对转化无明显影响。[结论]遗传转化成功地将外源基因OsMAPK2整合到水稻基因组中。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cD-NA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5’（Rf1b5’）,装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

烟草糖基转移酶基因启动子片段B的克隆与诱导表达

利用从烟草中克隆的一个新糖基转移酶(Glucosyitransferase,GTs)基因启动子中具有茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的片段,与GUS(β-glucuronidase)报告基因连接,构建部分启动子片段缺失载体.利用农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因植株,不同片段载体转基因植株的阳性率为50%～71%.对阳性转基因烟草植株GUS诱导活性的定量分析结果表明,在构建的4个表达载体中,启动子片段BA的基础表达水平非常低,并且不同转基因植株中都存在SA和MeJA双重诱导特征:片段BB和BC基础表达水平较高,不同转基因植株对SA和MeJA的反应不同:对于启动子片段BD,基础表达高于BA片段而低于BB和BC,不同转基因植株GUS活性均受SA诱导.推测在-756～-703之间(BA)存在MeJA和SA双重诱导元件,在-643～-606存在SA的诱导元件.对这些诱导元件的确定,有助于水杨酸和茉莉酸甲酯诱导机理的研究.     

水稻HL-CMS中2个雄性不育候选基因表达模式的初步研究

采用实时荧光定量PCR技术,比较了水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个雄性不育候选基冈HLsp和orfH79在根、茎、叶以及减数分裂期小穗和三核期花药中的表达模式.结果表明,HLsp和orfH79均在减数分裂期小穗中表达最高,而在营养生长的根、茎、叶及成熟花粉中表达很低.HLsp在粤泰A不同组织中的表达均低于orfH79,但HLsp在减数分裂期小穗中的表达量与在其它组织中的表达鼍的差异明显比orfH79大.2个不育候选基因HLsp和orfH79在HL-CMS不育系YTA不同组织及发育时期的表达差异,暗示二者在水稻HL-CMS的发生中可能行使不同的功能.     

1个烟草糖基转移酶启动子在拟南芥中的表达

从烟草中克隆到1个受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的糖基转移酶基因GT-MS,将其翻译起始位点5'上游800+1启动子序列取代pCAMBIAl301质粒的35S启动子,构建GT-MS启动子与Gus基因融合的植物表达载体,采用花序浸染法转化拟南芥,得到阳性植株.对转基因植株进行组织化学染色,结果表明,GT-MS启动子在拟南芥不同生长发育时期及不同器官均有表达,但主要是在维管组织表达,且韧皮部的表达高于木质部.MeJA和SA诱导后GUS活性增强,Gus基因RNA表达量成倍增加.表明GT-MS启动子与在烟草中相似,在拟南芥中也受MeJA和SA诱导.     

籼稻品种Kasalath遗传转化条件研究（摘要）

[目的]探索籼稻品种Kasalath的遗传转化条件,为针对该品种进一步的分子生物学研究奠定基础。[方法]以籼稻品种Kasalath的愈伤组织为转化受体,应用根癌农杆菌介导法进行遗传转化;从共培养方式、共培养时间、共培养后处理方法等方面优化遗传转化体系。①共培养条件的优化：愈伤组织接入共培养基时分2组,1组加1层灭菌滤纸,1组不加。②共培养时间的优化：分别于农杆菌液侵染愈伤1,2,3,4 d观察。③共培养后处理方式的优化：方式1,将共培养后的愈伤组织用灭菌蒸馏水冲洗多次至水清亮无混浊悬浮物,然后用含有羧苄青霉素的灭菌蒸馏水浸泡30 min,放置在有3层滤纸的灭菌培养皿中短暂干燥。方式2,将共培养后的愈伤组织置于带2层滤纸的灭菌培养皿中干燥,干燥3 d后取出。2种方式干燥后的愈伤组织均接入含40 mg/L潮霉素筛选压的筛选培养基上,筛选2次,每次2～3周。[结果]Kasalath的愈伤组织经农杆菌侵染后,经过共培养,再经筛选培养出抗性愈伤直至分化成转化苗,共培养时问对于转化效率的影响较大。如果共培养时间过长,将导致农杆菌过度生长,随后的筛选培养中即使加入抗菌的羧苄青霉素也无法抑制其生长,愈伤组织褐化死亡率增大。而共培养时间太短,则影响农杆菌Ti质粒T-DNA的转移,影响转化效率。该研究中当愈伤组织与农杆菌共培养时间为2 d时的转化效果最好,抗性愈伤组织获得率达84.1%,转化菌的转化率达到73%,且共培养时愈伤组织是否直接接触培养基对转化无明显影响。利用PMCG161载体引物PMCGF和PMCGR对所获得的部分转化苗进行PCR检测,23株转化苗中有13株扩出了预期的约750 bp条带,且为阳性转化苗,表明外源基因OsMAPK2已整合到水稻品种Kasalath的基因组中。[结论]经愈伤组织的诱导、共培养、筛选、预分化、分化等步骤,最终成功实现了农杆菌介导的OsMAPK2基因对籼稻品种Kasalath的遗传转化。     

利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36的初步研究

通过优化PCR扩增体系,利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36。结果表明,利用扩增长片段的LA Taq酶,结合使用GC buffer I,以及热启动PCR技术和两步法扩增,在退火温度为62℃和62.8℃时,得到了扩增效率较高,特异性高的16.5kb目标带。     

栽培稻与Oryza officinalis相似群野生稻基因组VDAC基因的比较

根据水稻基因组文库日本晴的基因组VDAC基因的序列,设计引物分别扩增6种不同基因组的野生稻(BB、CC、BBCC及CCDD)和2种栽培稻(AA)的基因组DNA的VDAC基因片段.所有分别代表8个VDAC基因的8对引物中,除引物VDAC3外,其它7对引物均能扩增出预期大小的特异条带,其中一些片段是所有试验材料共有的,而另一些则具有明显的基因组或种的特异性.AA、BB、CC基因组均具有VDAC1、VDAC4、VDAC7和VDAC8引物的扩增位点,而DD基因组则不能确定.VDAC6的引物位点是AA基因组所特有.VDAC2引物的扩增位点存在于基因组AA、BB、DD,而CC基因组中则无此位点.而VDAC5则可区分同为CCDD的宽叶野生稻和高秆野生稻.栽培稻种与野生稻种基因组相比能扩增出更多的VDAC基因片段的试验结果,为进一步研究稻属中VDAC基因的起源及进化关系提供了基础.     

不同光质间断暗期对农垦58s叶片细胞膜透性及外渗液主要成分含量的影响

短日照（１０ｈ）长暗期（１４ｈ）生长条件下的农垦５８ｓ幼苗,暗期红光间断处理后４ｄ,其叶片细胞膜透性,外渗液中蛋白质、可溶性糖及脯氨酸含量明显比远红光处理的低。处于育性转换敏感期的叶片短日照（１０ｈ）处理１１ｄ后其细胞膜透性,４ｄ后外渗液中蛋白质含量高于长日照（１４ｈ）处理的,而短日照处理的可溶性糖含量则低于长日照处理的。