草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。     

草鱼Ⅰ型胶原蛋白α1基因cDNA全序列克隆、组织分布及其生物信息学分析

利用PCR和RACE方法首次克隆了编码草鱼肌肉Ⅰ型胶原蛋白的α1基因(COL1A1)的cDNA全长序列,为5772bp,其开放阅读框为4347bp,编码1448个氨基酸。BLAST同源性分析结果显示,草鱼COL1A1基因的氨基酸序列与斑马鱼、金鱼同源性较高,分别为93.90%和93.60%,呈现出较高的保守性。系统进化树分析表明,该基因与斑马鱼、金鱼处于同一支,亲缘性最近。生物信息学分析显示,草鱼COL1A1蛋白质的相对分子质量为137.2ku,理论等电点是5.44,为α螺旋β折叠三重螺旋结构蛋白。有18段三重螺旋重复域,22段低复杂度域,17个功能域。COL1A1蛋白有33～69,1249～1355两个绑定钙的区域和62～104一个绑定锌的区域。利用半定量RT-PCR方法检测的组织表达结果表明,COL1A1基因在草鱼肌肉、肠道、肝胰脏、鳃、皮肤、鳍条、肾脏和脾脏8个组织中均有表达,其中在皮肤、鳃、肾脏、鳍条组织中的mRNA表达量高于其他4个组织(P<0.05)。     

草鱼APN基因的克隆及表达特征

氨肽酶N(APN)是肽酶M1家族的成员之一,在蛋白质的消化中发挥重要作用。采用同源克隆和RACE技术首次克隆草鱼APN基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为3258bp,包含27bp的5UTR序列,552bp的3UTR序列,2679bp开放阅读框,编码892个氨基酸;草鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为81.5%和75.4%,与其他动物同源性分别为58.8%～61.2%和54.3%～60.2%。经预测,其编码蛋白的分子量为100.61ku,等电点为5.14,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的1个螺旋跨膜结构,但跨膜区氨基酸同源性较低;系统进化分析表明,草鱼APN基因与斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-timePCR技术检测了该基因的发育表达,结果显示草鱼出膜4d后APNmRNA表达量相对稳定;APN在草鱼前肠、中肠和后肠均有较高的表达量,以前肠组织表达量最高;昼夜节律研究发现,肠道APN基因06:00-18:00的表达量较18:00-06:00高。     

草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其部分生物学性能

以草鱼鱼鳞为原料, 分别提取鱼鳞中的酸溶性胶原蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC), 着重开展了其包括热稳定性、体外酶降解性以及胶原海绵材料特性在内的相关研究, 并与哺乳动物来源的猪皮胶原(PC)相比较。实验结果表明, 制备所得的3种胶原蛋白均为典型的Ⅰ型胶原并具有完整的三螺旋结构; PC的热变性温度(41.6 ℃)明显高于ASC(34.8 ℃)和PSC(35.2 ℃); 3种胶原蛋白的体外酶降解性能受水解酶的种类、胶原蛋白提取方法、胶原蛋白来源、胶原蛋白受热历史以及蛋白的自组装程度影响。胶原蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对淡水鱼胶原均具有不同程度的降解能力, 但胶原蛋白酶的降解能力最强; 相同条件下, 3种胶原蛋白体外酶降解率依次为ASC>PSC>PC; 经热变性处理后胶原蛋白的体外酶降解率明显提高而经体外自组装处理后其体外酶降解率均出现不同程度的降低; 3种胶原样品冻干后得到的胶原海绵材料具有不同的机械性能和组织结构, ASC和PSC海绵是一种多孔但拉伸承受力较弱的海绵材料, 而PC则与之相反。     

80%赖氨酸硫酸盐与98%赖氨酸盐酸盐对生长中期草鱼生长性能、消化吸收能力和消化器官生长发育影响的比较研究

本试验通过比较80%赖氨酸硫酸盐[80%L-Lys·H2SO4,简称80赖氨酸(80-Lys)]与98%赖氨酸盐酸盐[98%L-Lys·HCl,简称98赖氨酸(98-Lys)]对生长中期草鱼生长性能、消化吸收能力和消化器官生长发育的影响,探讨80-Lys和98-Lys在草鱼上的生物效价并确定以80-Lys为赖氨酸(Lys)添加形式时饲料中Lys的适宜含量。选择初始体重为275.80 g左右的健康草鱼540尾,随机分成6组(每组3个重复,每个重复30尾鱼),分别饲喂Lys含量为0.8%(基础饲料)、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的添加80-Lys的饲料及Lys含量为1.2%的添加98-Lys的饲料60 d。结果表明:与基础饲料相比,饲料中添加适宜水平的80-Lys使饲料Lys含量达到1.2%时可显著提高生长中期草鱼的增重率(W GR),特定生长率(SGR),采食量(FI),全肠脂肪酶、淀粉酶活力,肝胰脏谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活力,前、中、后肠碱性磷酸酶(AKP)、肌酸激酶(CK)活力,肝体指数与肠体指数以及前、后肠皱襞高度(P0.05),显著降低血清GOT和GPT活力(P0.05),且80-Lys对上述指标的作用效果显著优于98-Lys(P0.05);此外,还可显著提高生长中期草鱼的饲料效率(FE),全肠胰蛋白酶活力,前、中、后肠Na+,K+-ATP酶(Na+,K+-ATPase)和γ-谷胺酰转肽酶(γ-GT)活力,肠长与肠长指数以及中肠皱襞高度(P0.05),但80-Lys对上述指标的作用效果与98-Lys差异不显著(P0.05)。由此得出,与98-Lys相比,80-Lys能更有效地提高生长中期草鱼的消化吸收能力,进而促进其生长。以80-Lys为Lys添加形式,以SGR和FE为标识,生长中期草鱼(276~667 g)饲料中Lys的最适含量分别为1.31%(占饲料蛋白质的4.68%)和1.27%(占饲料蛋白质的4.54%)。     

肠道菌群与草鱼个体大小相关性研究

[目的]探讨草鱼肠道菌群与草鱼个体大小之间的相关性。[方法]采用DGGE方法对同一批孵化并在同一池塘中养殖的个体大小显著差异的草鱼肠道样品进行分析。[结果]无论大个体草鱼还是小个体草鱼,其肠道优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门,但2组草鱼在其肠道菌群的结构和多样性等方面存在差异。大个体草鱼肠道中存在着更多比例的厚壁菌门以及具有纤维素降解能力的细菌,而小个体草鱼肠道中存在较多的潜在致病菌。[结论]草鱼肠道微生物可以作为内在因素影响草鱼的生长性能,这一结果也为进一步开发可促进草鱼生长性能的益生菌奠定了研究基础。     

高脂日粮添加胆汁酸对草鱼组织脂肪酸组成的影响

为研究高脂日粮添加胆汁酸对草鱼组织脂肪酸组成的影响,以豆油为主要油脂源设计3组等氮实用日粮,分别饲喂96尾草鱼(初体质量69.86g±6.24g)8周,设置对照组(CT,蛋白350g/kg,脂肪50g/kg)、高脂组(HL,蛋白350g/kg,脂肪70g/kg)与胆汁酸组(BA,蛋白350g/kg,脂肪70g/kg,胆汁酸60mg/kg)。结果表明,组织脂肪酸组成反映饲料脂肪酸组成。BA组腹腔脂肪组织中总脂肪酸、n-6多不饱和脂肪酸(PUFA)和亚油酸(LA,18∶2n-6)占油脂的质量百分比显著低于HL组,其在肝胰脏中趋势相反。与HL组相比,BA组肝胰脏中n-3PUFA占总脂肪酸的质量百分比显著升高,肌肉中则降低。3组肝胰脏中饱和脂肪酸(SFA)占油脂的质量百分比无显著差异;BA组腹腔脂肪组织中SFA占油脂的质量百分比显著低于HL组。BA组组织与饲料脂肪酸组成的相关性显著高于HL组,HL组显著高于CT组。综上所述,胆汁酸可能调控组织间脂肪酸的转运与蓄积,并提高组织与饲料脂肪酸组成的相关性。     

黄芪多糖对草鱼非特异免疫功能的影响

旨在探讨饲料中添加不同水平的黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)非特异性免疫指标的影响。将600尾健康草鱼随机分成Ⅰ-Ⅳ组,在基础饲料中分别添加黄芪多糖0、10.0、30.0、50.0 mg/(kg·d),于D0、D8、D15、D22、D29测定草鱼白细胞的吞噬百分比(PP)、吞噬指数(PI)及血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)与溶菌酶(LSZ)活力等指标,D29时对4组草鱼进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒实验。结果表明:与对照组相比,饲料中添加实验剂量的黄芪多糖可不同程度提高供试草鱼血液白细胞的吞噬百分比和吞噬指数,各实验组草鱼血清中T-SOD、CAT、LSZ活性均呈增加趋势,投喂实验剂量的黄芪多糖均可显著降低嗜水气单胞菌攻毒后草鱼的死亡率(P0.05)。研究表明,在饲料中添加适宜水平的黄芪多糖可提高草鱼的非特异性免疫功能和对嗜水气单胞菌感染的抵抗力,每千克鱼体质量的推荐剂量为10~30 mg/d。     

草鱼肝细胞脂变模型的建立及脂代谢基因表达分析

为了筛选草鱼肝细胞脂肪变性的最佳诱导剂及浓度,并初步分析脂肪乳剂(lipid emulsions,LE)引起草鱼肝细胞脂肪变性的作用机理,以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)正常肝细胞为研究对象,建立草鱼脂肪变性肝细胞模型,以含10%胎牛血清的基础培养液为对照组,处理组为含20%脂肪乳剂0.5~2 m L/L和含20%、50%胎牛血清的诱导培养液,孵育草鱼肝细胞48 h后,定量分析肝细胞内的甘油三酯(TG)含量,观察脂滴积聚情况及肝细胞超微结构的变化,检测细胞培养上清中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)的活性,q RT-PCR技术检测脂代谢关键基因(PPAR?、PPAR?、SREBP-1c、LPL、Lep和UCP2)的转录水平变化,蛋白质印迹技术检测PPAR?、SREBP-1c的蛋白水平变化。结果发现,含1~2 m L/L LE的诱导液组和含20%、50%FBS的诱导液组与对照组相比TG含量均显著上升(P0.05),且20%FBS和各浓度LE诱导组的转氨酶活性与对照组相比差异不显著(P0.05),表明含1~2 m L/L LE的诱导液和含20%FBS的诱导液均可建立草鱼营养性脂肪肝细胞模型。在肝细胞脂变模型中,PPARγ和LPL等脂代谢基因的表达量显著升高(P0.05),而Lep基因表达量显著降低(P0.05),PPARγ和SREBP-1c的蛋白水平升高。结论认为:采用1~2 m L/L LE和20%的FBS均可以在短时间内建立草鱼肝细胞脂肪变性模型,含1 m L/L LE的诱导液诱导效果最佳;肝细胞内脂质的蓄积可能与脂肪代谢关键基因PPARγ、SREBP-1c、LPL及Lep等密切相关。     

Characterization of the bacterial community associated with early‐developmental stages of grass carp (Ctenopharyngodon idella)

Bacterial communities in eggs and larvae of grass carp were analysed. During the early‐developmental stages, grass carp harboured five bacterial phyla, i.e. Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Planctomycetes and Firmicutes. However, the composition of bacterial communities varied among the different developmental stages. In eggs, the bacterial communities were dominated by Proteobacteria, while in larvae the dominant bacterial community was Bacterioidetes. With the exception of a large proportion (>50%) of uncultured bacteria, Sphingobacterium (14.75%) and Acinetobacter (13.11%) were the most abundant groups in eggs at the fertilization stage (FS). However, Aermonas was the most abundant group, ranging from 40.54% to 61.76% in eggs at the cleavage (CS), blastula (BS), organ differentiation (ODS) and hatching stages (HS). In larvae after first ingestion (OW), Chitinophagaceae (79.41%) formed the predominant bacterial community. Changes in the bacterial community were further confirmed by statistical analysis, which demonstrated significant differences in the bacterial communities of eggs at FS, eggs from CS to HS and OW. However, no significant difference was found in bacterial communities of eggs from CS to HS. Furthermore, the present study revealed that bacteria related to Chitinophagaceae persisted from CS to OW, suggesting that these bacteria form part of the autochthonous microbiota of the fish.