棉花SSR-PCR过程中聚丙烯酰胺凝胶电泳操作常见问题的解决与优化

在大批量聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中,难免会出现条带空白、弯曲或者拖尾等各种异常现象。本文以棉花DNA为例,综述了多年实验操作中遇到的突发情况及解决方法,为广大科研工作者提供参考。     

大樱桃基因组DNA提取及RAPD分析

以大樱桃8个品种为研究对象,利用改进CTAB法进行DNA提取,使用10碱基随机引物,通过PCR进行RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)扩增,建立了鉴定大樱桃品种的分子鉴定图谱。结果表明:较高质量的DNA和理想的RAPD反应体系能够保证RAPD技术具有较好的稳定性;筛选出的不同引物的RAPD扩增谱带组合可用于大樱桃栽培品种的分子鉴定,具有在生产应用的潜在性。     

基于核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列鉴定四季青及其近缘种和混伪品

中药材四季青(Ilicis Chinensis Folium)的基原植物冬青(Ilex chinensis)是重要的园林观赏物种。利用DNA条形码技术可以快速、准确鉴定四季青及其近缘种和混伪品。本研究以冬青、铁冬青(Ilex rotunda)、秤星树(Ilex asprella)、枸骨(Ilex cornuta)和女贞(Ligustrum lucium)等37份植物样本为实验材料,提取全基因组DNA,扩增核糖体DNA第二内部转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列并进行双向测序。测序结果利用Codon Code Aligner 4.2.7进行序列拼接,获得高质量ITS2序列。同时从Gen Bank中获得28条冬青的同属近缘种以及混伪品女贞、四川山矾(Symplocos setchuensis)的ITS2序列。基于隐马尔科夫模型(hidden Markov model,HMM)注释5.8S和28S,获得完整的ITS2区域,进而应用MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)进行冬青种间和种内序列分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ tree)。结果表明,琼脂糖凝胶电泳得到清晰明亮的均一条带,说明利用通用的ITS2引物可以成功扩增到用于测序的PCR产物。通过PCR产物测序、数据处理和序列分析可知,冬青种内ITS2长度经过比对后为239 bp,全部样品的种间ITS2比对后长度为269 bp。冬青种内有4个变异位点以及6个单倍型,种间有143个变异位点,远远多于其种内变异位点。MEGA6.0分析结果表明,种间最小K2P遗传距离(0.094)大于种内最大K2P遗传距离(0.013)。邻接树显示,女贞和四川山矾分别以100%的自展支持率分别聚类,表现出良好的单系性,冬青属物种聚为一大支。冬青在冬青属下可以单独聚为一支,可以进行区分。冬青属其他物种以同一亚属聚为一支。研究结果表明,作为一种快速、准确、简便的分子生物学鉴定方法,ITS2可以应用于冬青及其近缘种和混伪品的鉴定,同时对于准确鉴定冬青属物种亦有巨大潜力,可为冬青属植物在临床上的用药安全和开发应用提供科学依据。     

环境DNA在水生生态系统生物量评估中的研究进展

环境DNA (Environment DNA, eDNA)技术因其无创、高效、经济、灵敏等特点在水生生态系统生物评价中愈来愈引起人们的重视。文章围绕eDNA技术的内容、应用现状和面临的挑战3个方面,系统综述了该技术在实验室环境和野外环境水生生态系统生物量评估中的应用进展,探讨其优劣势、生态过程、评估错误等内容,展望了该技术在水生生物量评估领域的应用前景,以期为eDNA技术的相关应用研究提供参考。     

风湿祛痛胶囊中地龙药材的鉴定

目的地龙是巨蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。具有清热定惊,通络,平喘,利尿的功效。近年来,由于需求量大,出现地龙掺假的现象,于是采用分子生物学方法来鉴定地龙的真伪,同时建立一种鉴定地龙的方法。方法提取地龙粉末、地龙水提物、地龙醇提物、风湿祛痛胶囊的DNA,采用PCR方法得到PCR产物,并电泳鉴定其产物大小,鉴定地龙真伪,通过实验验证方法的稳定性。结果研究发现含有地龙的制剂的PCR产物均在260bp之间有单一条带,并摸索得出鉴定的条件为:95℃预变性5 min,35个循环(95℃变性30 s,58℃30 s,72℃30 s),72℃延伸5 min,经过验证具有稳定性。