高原牧区羊黑疫野毒分离株的生物学鉴定及免疫原性分析

为提高羊黑疫疫苗的免疫保护力,从青藏高原牧区病死羊体内分离的6株野毒株中筛选具有高免疫原性的B型诺维氏梭菌制苗用菌株,通过16S rRNA分子鉴定、α毒素基因片段的扩增、产毒素能力对比分析,筛选出1株产毒能力较高的TB05野毒株,以标准株为对照,研制了羊黑疫氢氧化铝菌苗,对其免疫原性进行了对比分析。结果显示,6株菌16S rRNA分子系统发育树亲缘关系较近,均扩增出大小为570 bp的α毒素基因片段;该TB05野毒株在含1.0%葡萄糖, pH值8.4～8.6的VF培养基中37℃72 h产毒最高,可达40 000 MLD/mL;疫苗对家兔的免疫保护力是对照组的2倍,血清抗体效价是对照组的3倍,免疫羊180 d后仍可抵抗2个致死量的攻击,免疫期远高于对照组的3个月。表明该野毒株具有较强的产毒稳定性和较好的免疫原性,可作为羊黑疫疫苗生产备用菌株。     

稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析

建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10~6个·mL^-1,细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg·L^-1;利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。     

羊种布鲁氏菌Rev.1株VjbR基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

本研究旨在构建表达载体pET-30a-VjbR,进而表达布鲁氏菌VjbR蛋白;利用生物软件分析该蛋白生物信息学信息,为进一步研究该蛋白奠定基础。以布鲁氏菌Rev.1株基因组为模板,扩增VjbR基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-30a-VjbR,并进行原核表达、Western-blot检测及该基因的生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了VjbR基因;经对表达产物进行SDS-PAGE分析纯化,发现本试验得到较纯蛋白;经Western-blot检测,发现该基因表达蛋白可与布鲁氏菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;通过生物信息学系列软件统计分析,发现VjbR蛋白无跨膜区,无信号肽,且该蛋白共有15个抗原决定簇,在二级结构中,α-螺旋的氨基酸有131个,占比为49.81%。布鲁氏菌VjbR基因的成功表达与纯化,为进一步制备该蛋白的单克隆抗体及iELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

ADV分离强毒株全基因突变重组质粒的构建、表达及其免疫原性的分析

为研制水貂阿留申病核酸疫苗,应用重叠延伸PCR技术去除ADV VP2基因中编码428~446位氨基酸的核苷酸序列,与pc DNA3.1(~+)载体连接,构建全基因突变重组质粒pc DNA3.1-ADV-428,在此基础上,截去编码487~501位氨基酸的核苷酸序列,构建全基因突变重组质粒pc DNA3.1-ADV-428-487。将构建的重组质粒经肌肉注射免疫小鼠,应用间接ELISA法检测接种后14、28、42、56 d抗ADV抗体水平;流式细胞术检测接种后第42天小鼠脾细胞CD3~+、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群。结果显示,小鼠接种质粒后CD3~+、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群数量均明显增加,第42天抗ADV抗体水平达峰值。本试验通过对ADV全基因突变重组质粒的免疫原性进行分析,为水貂阿留申病核酸疫苗的研制提供了参考。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)研究进展

猪传染性胃肠炎 (TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。 TGE首次由Doyle和 Hutchings1 946年在美国报道 ,日本 (1 95 6年 )和英国 (1 95 7年 )先后报道该病 ,这之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道发生了 TGE,现已成为一种世界性猪的疾病。我国从 6 0年代起就有TGE的报道 ,近些年来有进一步流行的趋势 ,尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行 ,给养猪业造成极大危害。在 1 984年和 1 986年间 ,欧洲北美等地又报道了一种特别的 TGEV自然缺失变异株 -猪呼吸…     

生长抑素(SS)与硫氧还原蛋白(Thioredoxin)相融合生成的2种基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表达特性

对基因工程化生长抑素（somatostatin,SS)-硫氧还原蛋白（Thioredoxin)融合蛋白SS－N／X和SS－N／S的表达产量、水溶性、Triton X-100对SS融合蛋白水溶性的影响、包涵体的溶解和复性特点以及SS的抗原性与免疫原性等特性进行了研究。结果显示，在30℃的低温下用IPTG诱导表达，SS－N／X融合蛋白主要以可溶性形式存在，占75．8％，色涵体仅占24．2％；而SS－N／S融合蛋白则主要以包涵体的形式存在，占81．1％，可溶性蛋白仅占18．9％；32C载体（pEG-32C)蛋白则居二者之间，可溶性蛋白与包涵体大约等比例出现。SS－N／S在低温下诱导可超量表达SS融合蛋白，其表达量约占菌体总蛋白的40．94％。0．5％ Triton X-100对融合蛋白的不溶性有非常显著的影响，几乎可使所有的SS－N／X融合蛋白和大部分SS－N／S融合蛋白及32C硫氧还原蛋白变成水溶性的。32C硫氧还原蛋白包涵体在尿素中的溶解度明显高于SS－N／S包涵体，2mol/L尿素可使近一半的32C硫氧还原蛋白包涵体溶解，而SS－N／S包涵体只有27．5％溶解；但在5mol/L尿素时，两者均可基本全部变为可溶性的。在SS融合蛋白包涵体溶解时加入还原剂二硫苏糖醇，可明显降低SS的抗原性。SS融合蛋白（水溶性融合蛋白和复性后的包涵体）具有良好的SS抗原性和免疫原性。由SS融合蛋白与弗氏不完全佐剂制成试验用疫苗，免疫BALB／c小鼠、仔猪和羔羊等动物，可显著提高免疫动物的增重。     

猪、犬旋毛虫成虫免疫原性试验

旋毛虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病 ,各国学者对旋毛虫免疫学进行了大量的研究。现已证实旋毛虫在黑龙江省有两个隔离种 :猪旋毛虫和犬旋毛虫。然而它们的免疫学研究报道较少 ,隔离种之间的交叉免疫方面的研究尚属空白 ,所以开展此项研究对免疫学、分类学的深入研究具有重要意义。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　旋毛虫虫种　猪旋毛虫 ,来自黑龙江省海伦县猪体内 ,在小鼠中继 3 5代 ,国际认证为旋毛形线虫 (Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉ ｒａｌｉｓ) ,编号ＩＳＳ5 3 3 ;犬旋毛虫来自黑龙江省五常县犬体内 ,在小鼠中继 3 5代 ,国际认…     

两株新城疫病毒的分离鉴定及免疫试验研究

通过对两株新城疫病毒的分离、鉴定，以及对分离株病毒的驯化、培养和灭活疫苗的研究，经与新城疫(LaSota株)油乳剂灭活疫苗的对比实验和与LaSota株混合制苗后均证实了与新城疫(LaSota株)油乳剂灭活疫苗在免疫原性与免疫后的抗体滴度、抗体持续期等方面均表现出一定的差异。     

PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上，成功构建重组表达质粒pET5-ORF6。将共转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）感受态细胞，重组菌经IPTG诱导表达，其细胞裂解物经SDS－PAGE可检测到分子质量约为19ku的目的蛋白带，经薄层扫描分析，目的蛋白占菌体总蛋白的26．8％，采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测，结果表明表达的蛋白显示特异性。