一种“高性价比”切胶纯化原核表达蛋白的方法

目的：建立一种低成本高效率的纯化表达蛋白的新方法。方法：在保证不改变原有蛋白生物活性的前提下,以NaAc染色切胶纯化方法为参考,通过以KCl取代NaAc染色目的蛋白、反复冻融后快速离心等操作步骤取代原来的电泳后过夜透析等实验步骤。结果：最终使原实验时间至少缩短2/3,而且所得目的蛋白不存在浓度和纯度降低的问题。结论：为许多条件有限的实验室进行纯化原核表达蛋白的研究提供了一种“性价比”更高的实用方法。     

鹅源肺炎克雷伯菌分离鉴定及其致病性分析

为了确证辽宁鹅源肺炎克雷伯菌的致病性,无菌采集鹅肺炎发病病例的肝脾和肺脏,应用细菌分离培养、生化试验以及PCR方法对分离出的细菌进行鉴定,选取所鉴定的代表菌株,应用小鼠和雏鹅进行致病性试验,结果确认分离到2株肺炎克雷伯菌。小鼠致病性试验显示发病率为95%,死亡率为90%,死亡小鼠表现脑实质出血、肝脏坏死有出血点、肺脏充血出血等病理变化。雏鹅致病性试验显示发病率为100%,死亡率为85%,死亡雏鹅表现气管黏膜出血、大叶性肺炎等病理变化。近年来,鹅源肺炎克雷伯菌引起鹅肺炎为主的疾病发病率、致死率越来越高,防治困难。本研究对鹅源肺炎克雷伯菌的致病性进行了分析,为进一步建立鹅源肺炎克雷伯菌病的诊断和防治技术提供了依据。     

PRRSV LN／0901株的分离鉴定及其NSP2基因遗传变异分析

采集可疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性的猪肺脏病料,通过Marc-145细胞培养、电镜观察、中和试验、RT—PCR检测等方法鉴定,确认从辽宁省分离到1株PRRSV,暂命名为PRRSVLN／0901株。进一步经Nsp2基因克隆测序及同源性比较及系统发育进化树等分析,结果证明该毒株属北美洲型,与2006年以来国内的多数流行变异株遗传关系相近且独立分支,说明导致辽宁地区流行的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病原属于北美洲型PRRSV,而且存在不断变异的趋势。     

猪流行性腹泻病毒重组M蛋白膜外区原核表达IPTG最佳诱导条件的确定

将猪流行性腹泻病毒编码M蛋白囊膜外区的基因片段（M’）亚克隆后，构建重组质粒pGEX-6p-M’并转化大肠杆菌以不同浓度IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明，在以浓度为0．3-0．5mmol／L的IPTG诱导6h条件下pGEX-6p-M’获得了最高效表达。     

辽宁省猪链球菌流行株主要血清型毒力因子检测及其致病性

为了解辽宁省猪链球菌流行菌株主要血清型毒力因子分布特征及致病性,依据猪链球菌属保守基因及血清型特异性基因,从辽宁地区采集猪链球菌疑似病例肺脏、肝脾、脑、关节液等样品进行猪链球菌及其血清类型鉴定;应用猪链球菌6种主要毒力因子特异性基因扩增检测方法,检测所分离到的不同血清类型猪链球菌的毒力因子分布情况,并应用小鼠攻毒试验和病理学技术对其致病性进行观察研究。结果显示:从辽宁地区采集的72个样品中共分离到23株猪链球菌,主要血清型有1,2,7型,其中SS1型4株,SS2型2株,SS7型5株。其余12株未确定血清型。SS1、SS2、SS7型阳性率分别为17.39%,8.69%,30.43%。毒力因子检测结果显示,上述6种毒力因子检出率分别为100%,66.6%,25%,16.7%,75.0%,58.3%,其中SS2均具备6种毒力因子,SS1、SS7和血清型阴性株猪链球菌均具有部分毒力因子,与SS2的差异毒力因子为epf。SS2可引起小鼠的急性败血症以及脑膜炎,SS1、SS7均可引起小鼠发病,但各器官的损伤则较轻。SS1、SS2、SS7脑内接种均可引起小鼠脑膜炎,炎症反应SS2最重,SS1次之,SS7最轻。     

猴B病毒抗体免疫梳检测方法的建立

为了研究猴B病毒(BV)抗体的快速检测方法,试验以采用基因工程技术制备BV的BV32基因原核表达产物重组BV32蛋白作为抗原诊断试剂,建立免疫梳(IC)方法用于特异性检测试验猴血清中抗BV的抗体IgG。结果表明:最佳抗原包被量为0.01 mg/m L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴B病毒阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应;能够敏感地检测到1∶400倍稀释的BV阳性血清;同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法对40份猴血清样品进行检测,与ELISA法检测结果一致率为98%,Kappa系数为0.997。说明免疫梳检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

翻转课堂教学模式在畜牧微生物学实验教学中的建立与应用

为了提高学生的应用能力和工作能力,笔者在通过对企业岗位调研的基础上,着手进行了与传统教学内容相对应的项目化教学内容的设计与实施。项目式教学中教学内容设计的容量大,课堂教学时间不能满足教师在传统教学模式下对每个项目涉及的所有知识点都讲解。要在限定的课时内完成项目式教学的教学任务,从2013年开始,笔者将翻转课堂教学模式引入了畜牧微生物学的实验教学,通过两轮的实践,不但完成了教学任务,学生的实践能力、动手能力和综合运用知识的能力得到显著提高。     

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LM iap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

猪瘟病毒核酸RT-RPA-LFD快速检测方法的建立

以猪瘟病毒(CSFV)5’端非编码区(5’UTR)为保守靶核酸序列,利用OLIGO7.0软件设计特异性扩增引物和标记探针,建立了可快速检测CSFV的反转录-重组酶扩增结合免疫侧流层析试纸检测方法(RT-RPA-LFD)。该方法在38℃下恒温30min内即可完成可视化反应,特异性强敏感度高,与其他猪的重要病原无交叉反应。该方法的CSFV RNA检出限(LOD)为2.2×102 copies/μL。上述结果表明,本研究建立的CSFV RTRPA-LFD检测方法操作简单、快速且直观,对没有PCR仪的地区的猪瘟诊断防控具有重要现实意义。     

副猪嗜血杆菌病的诊疗报告

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病是一种表现为多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等多种病症的猪传染性疾病,由具有多种血清型的革兰氏阴性杆菌——副猪嗜血杆菌引起。世界各主要养猪国家和地区都有关于该病流行和暴发的报道。该病常表现为散发性和继发性发病,当环境发生变化时或引起免疫抑制的因素存在时,会导致发病[1-2]。近年来,由于现代化养猪流通范