鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存和体外培养

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)鸡受精蛋性腺中的原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs),用不同的冷冻保护液对PGCs采用提纯后直接冷冻保存和在培养体系中培养24h后再进行冷冻保存,7d后复苏,用台盼蓝染色检测其存活率,并用PAS染色对冷冻后的PGCs进行特异性鉴定。复苏后的PGCs在培养体系中培养5d后,更换为培养体系继续培养,进行体外分化试验。结果如下分离后直接进行冷冻保存的PGCs复苏后存活率最高为(85.93±1.24)%;复苏后的PGCs在培养体系中培养48h后进行了PAS染色鉴定,结果PGCs呈PAS阳性(细胞核不着色,细胞质呈红色),表明PGCs的染色特性没有因冷冻保存和体外培养而发生改变;复苏后的PGCs在培养体系中培养可形成细胞克隆,当把PGCs更换到培养体系培养5d后,PGCs克隆有的仍保持克隆状态,但体积缩小,克隆中细胞排列紧密,颜色较深,有的克隆由鸟巢状变为不规则形,且在克隆周围形成类神经细胞样细胞。而经体外培养后再进行冷冻保存的PGCs,复苏后存活率最高为(42.26±1.36)%。     

1株木质素降解菌的筛选、鉴定及液态发酵条件优化

  目的  制作应用于园林绿化废弃物的以木质素降解菌为原材料的高效液体菌剂。  方法  通过苯胺蓝平板褪色圈法和愈创木酚平板变色圈法从分离纯化得到的22株菌中筛选目标菌株,并用内转录间隔区(ITS)测序法对目标菌株进行鉴定,然后通过单因素试验对目标菌株的培养时间、接种量和培养基配方(碳源和氮源)进行优化,最后根据单因素试验结果,采用均匀实验结合人工神经网络算法寻找目标菌株的最佳发酵条件。  结果  根据平板褪色和显色结果,选定菌株Q01为目标菌株。经鉴定,菌株Q01为栓菌属Trametes真菌。根据单因素试验和均匀试验结果,确定菌株Q01的最优发酵条件为培养时间5 d,接种菌液体积分数为12.5%;培养基配方为木质素磺酸钠14.00 g·L?1、蛋白胨12.30 g·L?1、酵母粉5.00 g·L?1、豆饼粉3.00 g·L?1、五水合硫酸铜0.12 g·L?1、氯化钠0.53 g·L?1、pH自然。优化条件后菌株Q01的生物量提高1.27倍,锰过氧化物酶活性提高31.71倍,木质素过氧化物酶活性提高19.12倍,漆酶活性略有降低,但3种木质素酶的总酶活性提高了4.38倍。  结论  菌株Q01在优化后的发酵条件下制得的液体菌剂具有高酶活性和高生物量的特点,在降解园林绿化废弃物木质素方面具有一定应用潜力。图6表3参29     

不同时期鸡胚胎体外培养的比较研究

试验采用代用蛋壳体外培养方法进行了不同时期鸡胚胎换蛋壳培养的研究。结果显示：体外受精卵体外培养发育率为10％。X期胚胎体外培养的孵化率为1．2％；孵化1日龄的胚胎体外培养的孵化率为7．9％；直接去1／4壳的鸡胚孵化率为3．7％；鸡胚胎换蛋壳以后，添加6～8札的稀蛋白对换壳鸡胚发育比较适宜。     

园林废弃物木质素降解真菌的筛选、鉴别及其能力研究

[目的]为获得能够高效降解园林废弃物的真菌并研究其降解能力,从经过堆肥处理的园林废弃物中分离和筛选出1株木质素降解能力较强的真菌。[方法]经过形态分析、ITS分子序列分析,构建系统发育树,鉴定出该株木质素降解真菌种属,并利用该菌株进行固态发酵实验,研究其在固态发酵过程中漆酶、锰过氧化物酶的酶活力变化及其对不同园林废弃物中木质素的降解能力。[结果]从经过堆肥处理的园林废弃物中共挑选出真菌18株,筛选出1株高效的木质素降解真菌,编号为菌株No.11,经鉴定该菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans(Eidam) G.Winter)。以冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶为底物的模拟固态发酵的漆酶酶活力峰值分别为388.7、326.3、461.4、342.7、588.5 U·L~(-1),锰过氧化物酶酶活力峰值分别为138.3、121.1、104.6、128.6、73.3 U·L~(-1)。添加菌株No.11使冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶40 d后木质素降解率分别提高了20.40%、22.44%、29.90%、25.28%、15.77%。[结论]筛选出的构巢曲霉对北京地区常见园林废弃物冬青卫矛、圆柏和连翘枝叶中的木质素具有较好的降解能力,在降解园林废弃物方面可能更具有优势。     

猪流行性腹泻病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，本研究根据PEDV ORF1a/b基因的保守序列，设计了8组特异性引物，以PEDC cDNA为模板，采用试剂盒推荐的各反应条件经LAMP扩增，根据LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳结果筛选最佳引物组。以筛选的外引物PE2 F3/B3经PCR从PEDV cDNA中扩增ORF1a/b基因，构建重组质粒p PE-ORF1-2并分别经PCR和测序鉴定。结果显示，2号引物组(内引物PE2 FIP/PE2 BIP，外引物PE2 F3/PE2 B3)为最佳引物。PCR和测序鉴定结果表明重组质粒正确构建，经计算其浓度为1.56×1011拷贝/μL，将其稀释1 000倍后作为质粒标准品。为建立检测PEDV的RT-LAMP方法，本研究对该方法的反应时间、反应温度、Mg2+浓度、内、外引物及d NTP浓度进行了优化，结果显示，RT-LAMP反应体系为：60℃反应50 min,Mg2+浓度80 mmol/L，内外引物终浓度分别为32μmol/L和5μmol/L,d NTP浓度10 mmol/L；通过在上述体系中加入甲酚红指示...