赤霉病菌拮抗菌Bacillus subtilis AF0907抗菌物质研究

菌株AF0907是从土壤中分离到的1株对小麦赤霉病菌具有显著拮抗作用的枯草芽孢杆菌,该菌株不仅对小麦赤霉病菌具有很好的拮抗活性,对其他多种植物病原菌都具有很好的拮抗效果.为了明确菌株AF0907对赤霉病菌的抑菌机理,本研究首先使用平板对持法对拮抗物质进行定位,结果表明该菌分泌的拮抗物质主要位于细胞上清液中.采用不同饱和度的硫酸铵沉淀细胞上清液,确定了60％的硫酸铵饱和度是沉淀该拮抗物质的最佳条件;分别研究了温度、pH值、蛋白酶K、氯仿对该拮抗物质活性的影响,结果表明该拮抗物质在低温下比较稳定,在60℃以上的高温下,活性迅速降低;在酸性或碱性条件下不稳定;该拮抗物质分别加入蛋白酶K和氯仿作用后拮抗活性分别下降了60.68％、80.07％,因此,初步判断该拮抗物质为蛋白质.利用DEAE-52离子交换柱层析法分离纯化了该拮抗蛋白并进行了SDS-PAGE电泳,结果显示该拮抗蛋白的分子量为48 kDa;利用PPSQ-31A蛋白自动测序仪测定拮抗蛋白N-末端15个氨基酸序列为:His-Glu-Phe-Pro-Thr-Tyr-Lys-His-Met-Tyr-Gln-Val Met-His-Leu.     

高效液相色谱法测定栀子苷的含量

建立了一种快速测定栀子及栀子黄中栀子苷含量的高效液相色谱分析方法。采用超声波法提取栀子苷,使用Shimpack HRC-ODS色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-水(30:70,V/V)为流动相,采用二极管阵列检测器(检测波长240nm)对栀子苷进行测定。结果表明,采用超声波法提取1.0h可将栀子苷提取完全,在2~24μg/ml范围内栀子苷含量与峰面积呈良好的线性关系,相关系数r=0.9986,精密度和稳定性试验相对标准偏差均小于5%,加样回收率达到98.13%。该测定方法简单、准确、精密度高、重现性好。     

高速逆流色谱分离紫苏酮的研究

紫苏酮是一种对试验动物肺部具有潜在毒性的物质. 该文采用高速逆流色谱分离法从紫苏叶中分离出了紫苏酮. 结果表明,以V(正己烷)∶V(乙醇)∶V(水)＝6∶5∶1 为溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相,转速为 800 r/min,流动相流速为 1.2 mL/min,进样 1 g 粗提物,6 h 后分离出 280 mg 紫苏酮,经气相色谱测定,组分纯度达到 98.8%,并用核磁共振等方法进行了结构鉴定.      

苹果多酚的超声波提取及抗氧化作用研究

苹果中富含维生素、矿物质、黄酮类、酚类等多种生物活性物质,具有预防多种疾病的作用,其中原花青素和绿原酸为苹果中主要的酚类物质,且具有很强的抗氧化作用. 该文以国光苹果为试验材料,通过对苹果多酚超声波提取条件的研究,确立了提取的最佳工艺参数,并对苹果多酚的体外抗氧化性进行了研究,采用DPPH法和2-脱氧-D-核糖法研究了苹果多酚对DPPH自由基和·OH自由基的抑制效果. 结果表明,乙醇可作为苹果多酚的良性提取溶剂,其超声波提取的最佳工艺条件:乙醇浓度为60％,料液比为1∶6,提取时间为20 min,提取温度为60℃,提取一次. 苹果多酚清除DPPH自由基速度快,其抗氧化能力可与葡萄籽多酚相媲美. 通过2-脱氧D－核糖法可以看出:在一定浓度范围内,苹果提取物有很强的抗氧化能力,其最佳浓度范围为8～10 mg/mL,此外,苹果提取物及葡萄籽提取物清除羟基自由基（5OH）的效果远远高于茶多酚.      

降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性

【目的】研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）降解菌Devosia sp. DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性,掌握DDS-1降解3-AC-DON到3-酮基-DON特性,为该酶的开发应用奠定理论基础。【方法】LG培养基培养DON毒素降解菌Devosia sp. DDS-1后,用PBS离心洗涤菌体后采用超声波破碎,用硫酸铵沉淀菌体破碎液获得粗酶液;然后在不同的酶反应体系中检测3-AC-DON氧化酶的酶活性。【结果】降解菌DDS-1产生3-AC-DON氧化酶的最适条件为：pH 7.0、25℃、培养36 h;该酶酶反应的最适温度为35℃,最适反应pH为7.0;该酶在20—40℃,pH 5.0—9.0的范围内能保持80%以上的酶活性;大多数金属离子在浓度为0.2—2 mmol•L-1对3-AC-DON氧化酶有促进作用;乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶活性有抑制作用;酶的定域试验结果显示该酶为胞内酶;DDS-1产生的粗酶液能很好地降解小麦中的DON、3-AC-DON毒素。【结论】Devosia sp. DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究表明,DDS-1产生的3-AC-DON氧化酶具有较好的温度和酸碱稳定性,该酶反应需要金属离子作为辅因子。     

Bt(Cry1F)毒素多克隆抗体制备及其检测应用

通过免疫新西兰大白兔,制备并纯化Bt(Cry1F)毒素多克隆抗体,建立针对Cry1F毒素检测的免疫学分析方法,用于室内分析毒素在农产品和土壤中的残留情况。采用皮下注射法,经4次级联免疫,获得免疫血清效价为1:2 500 000,经柱纯化后,测得抗体浓度为4.70 mg/m L;并以其建立的针对Cry1F毒素的间接非竞争时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA),测得线性检测范围在0.04~2 000 ng/m L,最低检测灵敏度为0.03 ng/m L,对5种供试毒素类似物(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry2A)均具一定交叉识别能力。分别以稻米和黄土为基质,进行添加回收试验,测得批内、批间的稳定性和重复性均达到室内仪器检测要求。     

Bt(Cry1F)毒素多克隆抗体制备及其检测应用

通过免疫新西兰大白兔,制备并纯化Bt(Cry1F)毒素多克隆抗体,建立针对Cry1F毒素检测的免疫学分析方法,用于室内分析毒素在农产品和土壤中的残留情况。采用皮下注射法,经4次级联免疫,获得免疫血清效价为1:2 500 000,经柱纯化后,测得抗体浓度为4.70 mg/m L;并以其建立的针对Cry1F毒素的间接非竞争时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA),测得线性检测范围在0.04~2 000 ng/m L,最低检测灵敏度为0.03 ng/m L,对5种供试毒素类似物(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry2A)均具一定交叉识别能力。分别以稻米和黄土为基质,进行添加回收试验,测得批内、批间的稳定性和重复性均达到室内仪器检测要求。     

超声波提取紫苏叶黄酮的工艺研究

采用单因素试验研究溶剂浓度、提取温度、超声波功率、科液比、提取时间、提取次数对超声波提取紫苏叶黄酮得率的影响。通过正交试验优化超声波提取紫苏叶黄酮的工艺条件。结果表明：随着乙醇浓度的增加,黄酮得率增加,乙醇浓度大于70％时,黄酮得率增加不明显：提取温度为60℃时,黄酮得率最大。随着超声波功率的增大,黄酮得率呈上升趋势：料液比增大,黄酮得率随之增大,但以不超过1：20（g／m1）为宜。黄酮得率随提取时间的延长而增加,但超过30min后,增加趋势不明显,各因素对黄酮得率的影响依次为：提取温度〉提取时间〉料液比〉超声波功率。70％乙醇为提取剂时,超声波提取黄酮的最佳工艺为：料液比1：20（g/ml）,提取温度60℃,超声功率150W,提取次数2次（每次40min）,该条件下紫苏叶黄酮的得率为2．93％,粗提物中黄酮含量为15．46％。     

金盏菊花黄色素的性质研究

该文采用溶剂提取法和紫外可见分光光度法 ,研究了金盏菊花黄色素的提取方法、稳定性和抗氧化性以及色素提取物的各项指标 .结果表明 :金盏菊花黄色素主要是类胡萝卜素 ,用等体积的石油醚和丙酮作浸提剂有较高的提取率 ,所得提取物呈红色油状液体 ,具有油溶性 ,各项指标均符合国家标准 ;该色素对热、酸、碱、氧化剂、还原剂、室内散射光、紫外光、络合剂及大部分金属离子稳定 ,但对日光及少数金属离子 (如Fe3+ ,Al3+ ,Cu2 + )不稳定 ;该色素有显著的抗油脂氧化效果     

小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟

【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热点残基预测发现Cry1Ac毒素和mALP中分别有3个氨基酸残基(376ASN、443SER和486SER)和4个氨基酸残基(452ARG、499THR、502TYR和513TYR)是参与互作的关键氨基酸位点。【结论】经原核表达的小菜蛾mALP同样具有与Cry1Ac毒素结合的能力,并利用分子模拟技术预测了小菜蛾mALP三维结构及与Cry1Ac毒素结合模式。