棉花脱水素GhDHN1的克隆及其表达

【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析,探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能,为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫2067为试验材料,根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素（dehydrin,Dhn）基因的CDS序列,利用Primer5软件设计引物,克隆该基因,并命名为GhDHN1;采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树;选择XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点对植物表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体pBI121-GhDHN1::GFP;分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位;利用抗冷材料豫2067在三叶期对低温处理（4℃,24 h）前后的叶片和根系进行转录组测序,筛选差异表达基因;在三叶期时分别对豫2067（抗冷品种）和衡棉3号（冷敏感品种）进行低温（4℃,24 h）处理,利用实时荧光定量方法分别比较根、茎、叶中GhDHN1表达量,对该基因在2个抗冷差异材料叶中的表达量进行比较;对豫2067进行不同时间低温（4℃）处理,分析GhDHN1在叶片和根中的动态表达模式。【结果】该基因全长为726 bp,开放阅读编码框为636 bp,编码211个氨基酸,预测分子量为23.79 kD,等电点为5.04,富含谷氨酸（26.10%）和赖氨酸（19.40%）,不含色氨酸,半衰期为30 h,蛋白呈酸性,带负带荷,带负电荷的残基总数为60%;GhDHN1的二级结构α螺旋（Alpha helix）包含116个氨基酸残基,占54.98%,组成该蛋白的主体结构,无规则卷曲（Random coil）的氨基酸残基有87个;GhDHN1位于陆地棉D亚组第9染色体（Dt_chr9）上,在cDNA的259-348位置上含有一个长度为90 bp的内含子,2个外显子长度分别为258和378 bp;SMART和CDD分析表明该氨基酸序列含有2个保守的富含赖氨酸的K片段和1个保守的富含丝氨酸S片段,具有亲水素蛋白结构域pfam00257,表明该蛋白为K2S型脱水素;系统进化树分析表明,陆地棉亲水素GhDHN1与可可亲缘关系最近;洋葱表皮细胞中瞬时表达分析表明,GhDHN1蛋白主要定位在细胞膜附近。转录组分析表明,该基因在棉花三叶期叶片和根中,受低温处理后上调表达;荧光定量PCR分析表明,GhDHN1在4℃低温胁迫24 h后,在叶片、茎、根中均上调表达,在叶中上调表达倍数最大,在低温处理4 h和24 h时叶片中有2个表达高峰,在低温处理6 h和12 h时在根中有2个表达高峰,在抗冷材料叶片中的表达是冷敏感材料的2.47倍,说明该基因可能参与了棉花对低温的适应性调控。【结论】陆地棉GhDHN1属于典型的K2S型脱水素,与可可亲缘关系最近。该基因响应低温胁迫,在抗冷材料和冷敏感材料中表达差异显著,其表达量与棉花的抗冷性呈正相关,可以作为筛选不同抗冷材料的标记,同时可以作为重要的候选基因来培育棉花抗冷新材料。     

陆地棉萌发至幼苗期抗冷性的鉴定

【目的】低温胁迫是影响棉花正常生长的重要因子之一,通过对棉花种质进行合理的抗冷性鉴定,可以为棉花的抗冷机制研究提供重要的先决条件,进而为棉花抗冷品种的选育提供一定的理论参考。【方法】利用4个抗冷性不同的陆地棉品种(系),设置0、4、10和15℃不同温度处理7 d,然后在正常条件(28℃,光照/黑暗,14 h/10 h)恢复生长7 d,筛选适合棉花萌发期进行抗冷性鉴定的低温条件;然后对4个品种(系)进行0℃低温处理1、2、3、4、5、6和7 d,恢复正常生长7 d,筛选萌发期抗冷性鉴定0℃低温处理的天数。对于芽期的抗冷性鉴定,选用抗冷性差异显著的2个陆地棉材料进行4℃低温处理0、1、2、3、4、5、6和7 d,筛选适用于芽期抗冷鉴定的低温处理的天数。将47个陆地棉材料(子叶期)进行4℃处理24 h,恢复正常生长7 d后调查冷害指数,鉴定棉花子叶期的抗冷性。采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定芽期和子叶期低温胁迫后的生化指标。【结果】通过对棉花不同时期,包括萌发期、芽期和子叶期进行不同低温胁迫条件的筛选,最终初步建立了适合棉花不同时期的抗冷性鉴定标准。0℃处理4 d,恢复正常生长7 d的相对子叶平展率可以作为萌发期的抗冷鉴定指标;4℃处理5 d,恢复正常生长的7 d的子叶平展率可以作为芽期的抗冷鉴定指标;4℃处理24 h,恢复正常生长的7 d的抗冷指数可以作为子叶期的抗冷鉴定指标。抗冷材料豫2067芽的SOD酶活和POD酶活均在低温处理前期呈上调趋势,之后下降至趋于平稳,而冷敏感材料衡棉3号芽的两种酶在低温处理前期迅速下降,然后上调后趋于平稳;2个材料芽的CAT酶活性在低温处理早期均先上升后下降,在冷处理后期抗冷材料豫2067的CAT酶活一直高于冷敏感材料衡棉3号;2个材料的可溶性蛋白含量在冷处理早期比较接近,在冷处理后期抗冷材料豫2067的可溶性蛋白含量一直高于冷敏感材料衡棉3号。4℃低温处理子叶期棉苗24 h后,抗冷材料豫2067子叶的SOD酶活力、POD酶活力、CAT酶活力均下降,而冷敏感材料衡棉3号的3种酶活力均上升,抗冷材料子叶中可溶性蛋白上升,冷敏感材料中的可溶性蛋白下降。【结论】棉花不同的生育时期应有相应的抗冷性鉴定标准,不同材料和不同生育时期的耐冷性鉴定标准具有差异性。推测棉花芽期抗冷性与酶活力有关。子叶期抗冷性与3种抗氧化酶活性差异不显著,可能与叶片中可溶性蛋白含量有关。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

棉花GhMGL11基因的克隆和表达分析

为研究陆地棉甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因的结构与功能,本研究以陆地棉中9807叶片为试验材料克隆得到棉花甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因c DNA全长,命名为GhMGL11(Cottongen:Gh_A12G2168)。蛋白序列分析该基因的编码区序列全长1 359 bp,编码452氨基酸;GhMGL11蛋白属于亲水性蛋白,预测含有41个磷酸化位点;亚细胞定位显示位于细胞质,无信号肽。序列比对分析,该基因含有Cys_Met_Meta_PP家族特有的保守结构域Cys_Met_Meta_PP,属于PLP(Pyridoxal phosphate)依赖性氨基转移酶中的一种。系统进化分析,陆地棉GhMGL11蛋白与可可(Theobroma cacao)亲缘关系较近。在陆地棉中发现23个与GhMGL11基因同源的含有Cys_Met_Meta_PP结构域的基因。组织特异性分析,GhMGL11基因在棉花根、茎、叶中均有表达,其中在根中的表达量最高;碱胁迫处理后不同时间内,该基因的表达量先升高后降低,说明该基因表达受碱胁迫影响。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1与拟南芥AtCOR47基因的比较

利用生物信息学分析了陆地棉脱水素基因GhDHN1与拟南AtCOR47基因的区别。结果发现，GhDHN1与拟南AtCOR47基因均有2个外显子，1个内含子；不同的是，AtCOR47基因的内含子和外显子均长于GhDHN1基因的。两个基因的内含子均有较高的AT含量，AtCOR47内含中AT的含量更高，两者外显子和内含子的剪接符合GT-AG规则。GhDHN1与AtCOR47基因所编码的蛋白质均为酸性，带负电荷，属于亲水性蛋白质，均属于SKn型脱水素，其氨基酸序列的一致性为45.2%；不同的是，AtCOR47比GhDHN1多一个保守性的K片段；GhDHN1和AtCOR47基因的启动子比较发现，2个基因的启动子中含有相似的响应非生物逆境胁迫的顺式作用元件和激素响应顺式作用元件，而GhDHN1拥有AtCOR47不具有的参与保卫与胁迫响应顺式作用元件TC-rich repeats，AtCOR47拥有GhDHN1不具有的乙烯响应元件。     

NaCl和Na2CO3对不同棉花基因组的DNA甲基化影响

【目的】探究不同盐胁迫后的棉花基因组DNA甲基化变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化差异,进而探究DNA甲基化与棉花耐盐性之间的关系。【方法】以陆地棉耐盐品种中9806和盐敏感品种中S9612为试验材料,分别用NaCl和Na2CO3（浓度均为0.4%）处理。提取对照和处理材料的DNA,进行双酶切、连接、预扩增和选择性扩增,然后采用MSAP技术（甲基化敏感扩增多态性）分析棉花幼苗在盐胁迫前后的DNA甲基化情况。从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化多态性片段并进行测序,通过NCBI进行比对分析;设计引物,用实时荧光定量PCR对多态性片段在棉花幼苗中的表达量进行验证。【结果】盐胁迫分析表明不同类型盐胁迫对棉花幼苗的影响不同;0.4%的中性盐NaCl对棉花幼苗的影响相对较小,各部分组织的形态变化不明显,而0.4%的碱性盐Na2CO3对棉花幼苗的影响较大,使棉花幼苗子叶变软,茎基部和根部发黑;MSAP分析结果表明,NaCl胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为23.5%和27.7%,其中,全甲基化比率分别为20.3%和22.9%,根部的甲基化比率分别为24.7%和27.1%,其中,全甲基化比率分别为19.6%和21.6%;Na2CO3胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为28.9%和28.1%,其中,全甲基化比率分别为24.3%和24.5,根部的甲基化比率分别为25.7%和27.6%,其中,全甲基化比率分别为21.5%和24.0%。叶片和根部甲基化水平存在差异,随着盐类型由中性盐向碱性盐转变的过程中,基因组DNA甲基化水平迅速增加,并在Na2CO3处达到最大值。通过分析胁迫以后的甲基化状态,在NaCl和Na2CO3胁迫后,中9806叶片的甲基化条带所占多态性条带比率分别为40.00%和50.00%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为54.12%和46.67%,中9806根部的甲基化条带所占多态性条带比率分别为35.53%和43.59%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为56.58%和51.28%。而中S9612叶片和根部中的甲基化条带比率和去甲基化条带比率的变化不明显。对多态性片段回收共获得6条序列,这6条序列涉及不同的同源基因,在基因编码区和非编码区均有分布,参与不同的代谢反应。qRT-PCR分析结果表明,6个同源基因在对照和处理之间的表达差异显著。【结论】耐盐性不同的棉花品种对盐胁迫反应不同,耐盐品种中9806在中性盐NaCl胁迫后基因组甲基化水平降低,诱导相关耐盐基因表达来抵抗胁迫而盐敏感品种中S9612则缺乏相应的耐盐基因使植株受到伤害增加,在Na2CO3处理以后受到伤害最大,对照与处理间甲基化水平差异显著,叶片和根部甲基化水平存在差异,具有组织特异性;多态性片段比对分析可知,同源性基因涉及多条代谢途径,通过多种代谢途径间的协同作用来抵抗胁迫。