适用于蛋白质双向电泳的棉花胚性培养物蛋白质提取技术

 以陆地棉品种Coker 201为材料，对与甲醇/醋酸铵丙酮沉淀结合的酚抽提法和裂解液配方进行了优化，建立了适用于蛋白质双向电泳体系的棉花胚性培养物蛋白质样品制备技术。对胚性培养物，通过添加PVPP研磨和丙酮、TCA/丙酮、甲醇/醋酸铵等有机溶剂的系列洗涤，然后再进行酚抽提，蛋白质质量得到显著改善，获得的2-DE图谱质量高、可分辨的蛋白质点数多。比较分析3种裂解液对蛋白质的溶解效果发现，在裂解液中混合采用7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲以及4% CHAPS是最有效的配方。     

油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905的研制及应用

转基因油菜是我国转基因生物安全监管的重要对象,为了解决检测机构常常面临的标准物质(样品)缺乏困境,统计我国批准进口和正在申请安全证书的11个转基因油菜品种,分析分子特征和相应的检测标准方法,确定每个转基因油菜品种的检测靶标序列。将11个转基因油菜品种的检测靶标序列通过基因合成的方法融合构建到pUC18载体上,研制出阳性质粒分子pYCID-1905,为转基因油菜的转化体鉴定检测提供了通用的阳性对照分子。结果发现,该质粒分子可同时用作国家标准(GB/T)、农业农村部公告、进出口检验检疫标准(SN/Y)和欧盟标准中普通PCR方法和实时荧光PCR方法的阳性对照,可以解决转基因油菜检测中缺乏标准样品的难题。     

一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定

棉花纤维是研究单细胞生长发育的良好模式细胞,寻找在棉花纤维发育时期优势表达的启动子,对于棉花纤维发育的功能基因组研究非常重要。本试验对发掘到的一个在纤维伸长期优势表达基因GhFLA1的启动子进行克隆,并将该启动子融合GUS转化棉花和烟草。转基因棉花的GUS蛋白染色表明,在0~20 DPA(days post anthesis)的纤维中检测到GUS蛋白,同时在柱头、雄蕊、萼片、胚根、子叶和根中也检测到GUS蛋白,但在花瓣、叶片和苞叶中没有检测到。同时GUS定量检测结果显示,pGhFLA1驱动GUS蛋白积累的高峰是在20 DPA的纤维中,其驱动GUS表达的能力是Ca MV 35S::GUS的22倍。转基因烟草组织化学染色显示pGhFLA1可以驱动GUS在叶片及叶片的表皮毛中优势表达,同时在子房、柱头、花药、苞叶、花柄基部、花瓣、种子等生殖器官上也存在GUS蛋白。启动子pGhFLA1在棉花纤维和烟草叶片的表皮毛中优势表达,可用于棉花纤维功能基因组研究,在改良纤维品质育种中具有潜在的应用价值。     

大麦新品种扬农啤7号高产栽培技术

扬农啤7号（原名苏B0505）由扬州大学农学院于2005年育成。2010年2月江苏省作物品种审定委员会鉴定通过,鉴定编号：苏鉴大麦201001。该品种于2010年由江苏申川种业有限公司引进,上海市川东农场种植业中心并在第一、二、五、七作业区进行了高产栽培技术研究。1产量表现2010年秋播,七区播期10月30-31日,667m2播量9.25kg,播种面积29.48hm2;一区播期11月2-5日,播量11.5kg,播种面积46.23hm2;二区播期11月6日,     

抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性定量PCR检测方法的建立及其标准化

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已获得中国进口加工原料安全证书，建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法，为抗逆大豆IND-??41?-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-??41?-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针，结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针，随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选，遴选出1对候选引物探针；设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度，优化qPCR方法的反应体系；设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性；以纯合抗逆大豆IND-??41?-5基因组DNA作为标准样品，梯度稀释成标准溶液模板，绘制标准曲线，考察qPCR方法的线性动态范围，配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品，评价定量方法的准确性；配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品，测试方法的检出限；拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试，确定方法的定量限；最终确定抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧...     

抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 RPA快速检测方法的建立

瑞丰125为农业农村部首批获得生产应用农业转基因生物安全证书的抗虫耐除草剂转基因玉米之一。为给监管转基因生物安全提供支撑，利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术，针对瑞丰125的转化体插入位点序列设计了引物并进行筛选，对反应的温度、时间和引物浓度进行了优化。结果显示，RPA体系在30～45℃范围内，20 min即可有效扩增，比PCR检测时间大大缩短。引物浓度会影响RPA的扩增效率，引物终浓度为0.35μmol/L时扩增效果最好。同时对RPA检测方法的特异性、灵敏度等进行考察，结果表明该检测方法的特异性良好，检测灵敏度可达到36拷贝。该恒温快速的检测方法为瑞丰125的快速检测提供依据，为商业化转基因作物的监管提供支撑，有望用于转基因成分的现场快速检测。     

转基因定量检测结果测量不确定度的自上而下评定方法研究及应用

【目的】定量检测标准体系是实施转基因定量标识的基础，而不确定度评定是定量检测标准体系的重要组成部分。急需建立适合一般实验室采用的标准化转基因定量检测结果不确定度的自上而下评定方法，以便检测实验室自行评定定量检测结果的测量不确定度。【方法】测量方法精密度不确定度评定有2种方法，一种是根据“不确定度函数”的一般概念，利用15个不同浓度的常规样品，建立测量方法精密度引入的不确定度评定公式；另一种是重复测量有证标准物质，根据检测数据的中间精密度，计算方法精密度引入的不确定度。用有证标准物质或实验室配制样品作阳性定量质控品进行偏倚不确定度评定，实验室配制样品标称值的不确定度由实验室根据制备过程采用简易程序自行评定。将测量方法精密度引入的不确定度和测量过程的偏倚不确定度合成，评定试样定量结果的标准不确定度，然后乘以包含因子k，获得扩展不确定度。【结果】以转基因玉米DBN9936定量检测方法为例，分别用模拟的DBN9936常规样品和有证基体标准物质（GBW(E)100901）评定测量方法精密度引入的不确定度，分别为0.76%和0.33%，与常规样品相比，用有证标准物质评定的测量方法精密度不确定度显著...     

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础，是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料，其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料，对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测，按质量分数(以干基计)称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1 000.0 mg·g^-1的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检，初检合格后分装。用MON87427/zSSIIb二重微滴数字PCR(ddPCR)方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343)进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON8742...