不同无核葡萄品种花粉贮藏及其生活力的测定

以‘京丰无核’‘爱神玫瑰’‘杨格尔’‘奥迪亚无核’和‘奇妙无核’5个葡萄品种的花粉为试验材料,撒播在10%蔗糖+10 mg·L~(-1)硼酸+6 g·L~(-1)琼脂的培养基上进行离体培养,研究不同处理方法(液氮未处理、液氮处理)、不同温度(25、0、-20、-40、-80℃)、不同贮藏时间(1、3、5 d)对5种葡萄花粉生活力的影响。结果表明:‘爱神玫瑰’的单花药花粉量最多,达到(5 446±80)粒;‘京丰无核’的新鲜花粉生活力最高,为(68.19±2.98)%,‘奇妙无核’的新鲜花粉没有萌发。液氮未处理和处理后观察发现,液氮处理后花粉生活力远远低于液氮未处理的,液氮未处理的同一品种不同处理花粉生活力对比发现,最适宜长期贮藏的温度是-80℃,其次是-40℃,25、4、-20℃条件下贮藏花粉生活力降低较快。不同品种花粉贮藏后,‘京丰无核’花粉萌发率最高,为(55.87±1.14)%,较差的是‘杨格尔’,其花粉萌发率比‘京丰无核’花粉萌发率低17.84%,‘奇妙无核’没有萌发,杂交授粉时,适宜的父本为‘京丰无核’‘爱神玫瑰’与‘奥迪亚无核’。     

白粉菌诱导的华东葡萄环化cDNA文库中抗病基因筛选

【目的】从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。【方法】根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡萄白粉菌接种诱导后的叶片cDNA文库进行PCR筛选。【结果】共建组池24个,每个组池中含有单菌落768个,包含18432个克隆。从中筛选出具有抗病基因保守序列的阳性克隆585个,其中具有NBS保守序列引物筛选出330个,LRR保守序列引物筛选出255个。对获得的阳性克隆中的插入片段进行了测序,经生物信息学分析去除重复序列后,获得422条具有抗病基因保守结构域的基因序列,其中具有NBS保守序列的250条,具有LRR保守序列的172条,共有NBS和LRR保守序列的25条。【结论】经翻译分析,其中8条编码产物包含NBS的P-loop结构域(GW787739—787742、GW787746、GW787747、GW787749、GW787758),5条编码产物包含LRR结构(GW787743、GW787744、GW787750、GW787751、GW787753),1条华东葡萄特有基因(GW787754)。从中选出具有不同抗病结构域的10条基因进行病源侵染过程中的基因实时定量表达分析,发现其中5条抗病相关基因的表达可被白粉菌接种所诱导,可能与白粉病侵染过程有关。     

华东葡萄抗白粉病杂种后代cDNA文库的构建及EST序列分析

以抗白粉病的华东葡萄杂种后代6-12-4株系为试材,利用SMARTTM技术构建了白粉病病原菌诱导的全长cDNA文库。经检测,原始文库滴度为2.50×106pfu·mL-1,重组率达到99%,扩增文库滴度为3.0×109pfu·mL-1,重组率达到95%,插入片段长度在500～2000bp。随机挑取300个克隆,测序获得260条质量较高的ESTs,聚类及拼接后,共得到183个一致序列(所获序列已经提交GenBank,登录号为FG579859-FG580039)。经蛋白功能预测分析,获得含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白、MYB类转录因子、水通道蛋白、富含脯氨酸蛋白、亲环素蛋白、ACI14蛋白、转脂蛋白等抗病相关基因,涉及到植物的信号转导,胁迫诱导,防卫反应等方面。这些EST序列为利用中国野生华东葡萄进行抗白粉病育种研究和利用提供了有价值的抗病基因片段,为丰富世界葡萄属植物抗白粉病基因提供序列数据。     

火焰无核葡萄花粉离体萌发试验

以欧洲葡萄火焰无核的新鲜干燥花粉为试验材料,在不同浓度蔗糖、硝酸钙和硼酸单因素试验基础上开展正交试验,研究不同培养基对花粉的离体萌发和生长的影响,以筛选适宜火焰无核葡萄花粉离体萌发的培养基。结果表明:蔗糖对火焰无核葡萄的花粉离体萌发和花粉管生长的影响效果最大,硼酸的影响效果略差于蔗糖,最后是硝酸钙,其影响效果最小;花粉萌发的适宜培养基是:蔗糖250g·L-1+硼酸0.08g·L-1+硝酸钙0.05g·L-1,萌发率达到22.22%。     

中国野生华东葡萄抗白粉病相关基因(VpUSP)克隆及表达分析

根据从本课题组前期构建的中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下的cDNA文库中获得的1条与抗白粉病相关的EST序列,设计特异引物,结合RACE(Rapid-amplrfication of cDNA ends)技术克隆了中国野生华东葡萄白河-35-1广泛逆境蛋白基因(Univetsal stress pr...     

葡萄花粉不同贮藏条件下生活力的鉴定

本试验以有核葡萄品种和无核葡萄品种的新鲜干燥花粉为材料,每个品种分别贮藏在25℃、5℃、0℃、-20℃、-40℃条件下,采用蔗糖200 g/L+硼酸50 mg/L+琼脂8 g/L的同一固体培养基作为营养基质,进行花粉离体培养。结果表明:刚开始贮藏时不同品种之间的花粉生活力存在明显的差异,其中有核葡萄品种的花粉生活力高于无核葡萄品种,并且不同温度下贮藏的花粉其生活力随着贮藏时间的延长均呈下降的趋势,-20℃、-40℃贮藏条件下的花粉生活力下降速度较缓慢,25℃贮藏条件下的花粉生活力下降速度较迅速。     

中国野生葡萄抗寒基因的RAPD标记及其序列分析

以抗寒性存在差异的83份葡萄种质及3个杂交组合玫瑰香(Vitis vinifera)×黑龙江实生(V.amurensis)、北醇(V.vinifera×V.amurensis)自交、燕山-1(V.yes hanensis)×河岸-3(V.riparia Beaumont)的F1代122株为试材,进行了中国野生葡萄抗寒基因RAPD标记的研究。通过对110个随机引物的筛选,获得了2个与中国野生山葡萄抗寒基因相连锁的RAPD标记S241-670和S238-800。通过克隆、测序,这2个RAPD标记的实际长度分别是717bp和854bp,因此重新命名为S241-717和S238-854,其序列的GenBank登录号分别为GQ338290和GQ338289。经序列分析,S241-717与29条欧洲葡萄全基因组鸟枪序列有77%~97%的同源性,S238-854与6条欧洲葡萄全基因组鸟枪序列有82%~100%的同源性;二者分别编码欧洲葡萄的一种假定蛋白。RAPD标记S241-717和S238-854可用于葡萄抗寒育种的早期分子标记辅助选择。     

欧洲葡萄VvMYB6正向调控花青素合成

从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个MYB转录因子基因VvMYB6。VvMYB6蛋白定位在细胞核,其N端包含1个保守的R2R3结构域。在葡萄中,VvMYB6主要在在根、花器官及果实发育早期表达。在烟草中异位表达VvMYB6,显著促进花瓣和雄蕊中花青素的积累;代谢组分析发现,相比野生型,转基因植株花中累积高含量的飞燕草色素和矢车菊色素。转基因烟草植株中查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮4–还原酶(DFR)、花青素合酶(ANS)和UDP葡萄糖–类黄酮–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)基因表达显著上调。结果表明VvMYB6正向调控花青素合成。     

华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析

以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料,用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度0.92×106 pfu/mL,重组率97%,插入片段500～2 200 bp,扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序,获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析,有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性,14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。