过去十年影响世界家禽业的11件大事

现在非常流行制作年度或十年重要事件回顾,国际资深编辑Chris Wright认为二十一世纪头十年影响世界家禽业最重要的11件大事及技术革新是：     

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒（ARV）σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARV σB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARV σB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。     

3株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列分析

通过对3株鸡传染性贫血病毒(CIAV)的全基因组序列比较分析,部分表明广西南宁鸡群CIAV毒株的遗传变异特征。将阳性CIAV的组织样品进行DNA抽提后,运用PCR方法分段扩增CIAV的全基因组,将获得的PCR产物进行基因克隆并进行阳性克隆菌鉴定后送测序。将所获得的基因序列进行拼接成CIAV基因组全长后,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对CIAV全基因、Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1)和Viral protein 2(VP2)基因序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析和遗传进化分析;并对VP1、VP2和VP3蛋白上与毒力、蛋白磷酸酶活性和细胞凋亡相关的氨基酸位点进行分析。结果获得3株CIAV的全基因序列,分别命名为GX1801、GX1804和GX1810;CIAV全基因遗传进化分析表明GX1801、GX1804和GX1810均同属于Group A群,与国内强毒株GD-103和GD-104毒株的亲缘关系较近;基于VP1基因构建的遗传进化树与全基因构建的进化树最相似;GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上与毒力相关位点的第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点与日本强毒株C368株、国内强毒株GD-103和GD-104株在同一位点保持一致;GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上与磷酸酶活性相关的基序(I^94CNCGQFRKH^103)均未发生变异;GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与诱导细胞凋亡相关的重要区域(VP3蛋白N端结构域的第1~69位氨基酸)均高度保守。本研究对3株CIAV全基因组进行测定并进行基因分析,获得了其基因组特征,为进一步研究广西CIAV的分子流行和致病性提供参考。     

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV （A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe （5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团）和CIAV-Probe （5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团）]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×Reaction Mix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP （工作浓度40.0μmol/L）各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作浓度5.0μmol/L）各0.4μL,ALV-Probe （工作浓度0.5μmol/L）0.4μL,CIAV-Probe （工作浓度0.5μmol/L）0.8μL,以ddH₂O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。     

基于石墨烯电化学免疫传感器检测牛病毒性腹泻病毒

构建一种新型电化学免疫传感器用于检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),为BVDV提供一种新型快速的检测方法。利用甲壳胺(Chi)修饰石墨烯(G)并负载金纳米粒子(AuNP),得到石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子(G-Chi-AuNP)纳米复合物用于修饰金电极,然后固定抗BVDV NS3蛋白单克隆抗体,构建BVDV电化学免疫传感器。所构建的电化学免疫传感器对BVDV的检测敏感度为10~(1.2) TCID_(50),特异性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛分支杆菌(MB)、牛冠状病毒(BCV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。研究建立的BVDV电化学免疫传感器具有特异性好和灵敏度高的优点,在BVDV快速检测领域具有良好的应用前景。     

禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达

本研究参照GenBank中编码禽源热休克蛋白HSP70、HSP40和核糖体蛋白RL4等的基因序列,分别设计特异性引物,采用RT-PCR扩增HSP70、HSP40和RPL4基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40和pEF1α-Myc-RPL4;将构建好的重组质粒,转染HEK293T细胞后,采用间接免疫荧光和Western-blot技术,对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-HSP70、Myc-HSP40和Myc-RPL4融合蛋白在HEK293T细胞内得到了正确表达。本研究为后续禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的功能研究奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

2株广西鹅源基因XII型新城疫病毒的病原学分析

【目的】深入了解2株广西鹅源基因XII型新城疫病毒（NDV）的病原学特征,为NDV流行分布的系统监测和新城疫（ND）的科学防控提供参考依据。【方法】对2株广西鹅源基因XII型NDV（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）进行病毒噬斑纯化,通过致死鸡胚平均死亡时间（MDT）和脑内接种致病指数（ICPI）试验确定其致病性,分析F蛋白和HN蛋白氨基酸序列与参考毒株的差异位点,并基于F基因全长进行遗传进化分析。【结果】经过DF-1细胞4个代次噬斑纯化可获得2株分离株的纯化株,对应的MDT分别为54和48 h,ICPI均为1.65。2株分离株的基因组长度均为15192 nt,其3'端引导序列为55 nt,5'端尾随序列为114 nt;基于F基因核苷酸序列相似性构建的基因XII型NDV系统发育进化树显示,2株分离株（Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018）均属于基因XIIb亚型,与我国广东分离株属于同一基因亚型,且我国2010年的分离株、2011年的分离株及2017年后的分离株分别形成3个小分支。2株分离株的F蛋白裂解位点均为112RRQKRF117,与南美分离株（XIIa亚型）和越南分离株（XIId亚型）相比,在信号肽区域、融合肽区域、七肽重复区和跨膜区共有14个氨基酸差异位点,其中2个氨基酸差异位点（19I→V和294N→S）是广西分离株所特有。2株分离株的HN蛋白跨膜区及抗原中和区氨基酸序列与我国广东分离株均一致,与南美分离株（XIIa亚型）相比存在7个氨基酸差异位点（27V→I、28A→S、34V→I、41A→T、42V→A、263K→R和347E→D）。【结论】我国分离株（XIIb亚型）与南美分离株（XIIa亚型）和越南分离株（XIId亚型）在F蛋白和HN蛋白的氨基酸差异可能与其对鸡群的致病力差异有关。此外,基因XII型NDV一直处于不断进化中,而需持续监测该基因型NDV的流行分布情况。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PRRSV和PCV2。