猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6/7基因真核载体的构建

针对PRRSV ORF5～ORF7设计3对特异性引物,以PRRSV GD-XH株和GD08-1株为模板进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7),然后将重组表达质粒转染Marc-145细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7)和载体pEGFP-N1均有绿色荧光出现.结果表明:成功构建了表达PRRSV GD-XH株和PRRSV GD08-1株的GP5、M、N蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1-GD-XH-GP、pEGFP-N1-GD-XH-M、pEGFP-N1-GD-XH-N、pEGFP-N1-GD08-1-GP5、pEGFP-N1-GD08-1-M、pEGFP-N1-GD08-1-N.     

猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析

根据美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)基因组序列设计2对引物,对疑似PRRSV感染猪的病料进行RT-PCR检测,核酸检测阳性病料进行PRRSV分离,获得了1株美洲型PRRSV,命名为GD08-2.对PRRSV GD08-2株、GD-XH株、GD08-1株的ORF5基因和部分Nsp2基因进行序列测定与分析.结果表明,GD08-2株的ORF5基因与PRRSV疫苗株pMLV、经典株VR-2332和GD-XH株的相似性较高,而与GD08-1株的相似性较低.GD08-2株的Nsp2基因推导的氨基酸序列出现12个氨基酸的不连续缺失,分别位于66~74位和192~194位,由此推测,GD08-2株可能为PRRSV的突变株.GD08-1株的ORF5基因与国内分离的高致病性PRRSV相似性较高,其Nsp2基因推导的氨基酸序列存在30个氨基酸的缺失,与国内高致病性PRRSV分离株JXA1的缺失位置完全一致,由此推测,GD08-1株属于高致病性PRRSV;GD-XH株的ORF5基因与疫苗株pMLV的相似性较高,其Nsp2基因存在个别核苷酸的点缺失.遗传进化分析表明,GD08-1株与国内分离的高致病性PRRSV的遗传进化关系较近,属同一分支;GD-XH株和GD08-2株与PRRSV经典株VR-2332、疫苗株pMLV的遗传关系较近,属另一分支.     

广安市土地利用存在的问题及对策

分析了广安市土地利用现状和上一轮土地规划中存在的问题,提出了相应的对策.     

一例蝴蝶犬咬伤的诊治

正犬猫咬伤为外科常见疾病。因犬具有领地意识,并且在其发情季节求偶,常导致犬与犬之间进行打斗,相互造成伤害。临床常见的犬咬伤多发生在性格好斗的犬之间,比如斗牛犬、狼犬等,但有时也会出现在性情温和的犬中,前者受伤的多为同类犬,后者多为小型犬[1]。临床上要依据咬伤的部位和程度给与及时处理。2017年2月14日,笔者接诊一条蝴蝶犬,经中西医治疗咬伤取得良好效果,现介绍如下。1伤口的检查与处理     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT—PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank收录的PRRSV基因序列，利用PRRSV经典变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点，设计合成两对特异性引物，经RT-PCR扩增后，用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化到大肠杆菌DH-5a株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定，证实为PRRSV缺失变异株与经典变异株的阳性重组质粒。将重组标准质粒进行10倍系列稀释后作为模板，通过实时荧光定量PCR法（Realtime PCR），建立了PRRSV缺失变异株与经典变异株的标准曲线及其直线回归方程，并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点，为鉴别诊断及分析PRRSV缺失变异株与经典变异株感染猪体内病毒的绝对含量提供了技术手段。     

猪树突状细胞的体外培养及其主要免疫生物学特性研究

为建立体外诱导、培养猪外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)的方法,并对其进行免疫生物学特性鉴定,本实验从猪外周血无菌分离单核细胞—DC前体细胞,以猪源重组GM-CSF和IL-4联合诱导培养,从形态学、表型及功能方面对其进行检测。结果证实,经体外诱导培养的猪DC具有典型的树突状形态;培养6d的未成熟DC表面SLA-II-DR、CD1、CD172a表达的阳性率分别为61.50%、83.10%和24.90%;培养8d的成熟DC表面SLA-II-DR、CD1、CD172a表达的阳性率分别为71.70%、50.10%和19.30%;培养的DC具有吞噬异物的功能,以及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。本文首次在国内成功地建立了体外培养猪外周血单核细胞来源DC的方法,为进一步研究DC在猪传染性疾病致病机制中的作用奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通过降解IκBα激活NF-κB信号通路

核转录因子κB(NF-κB)在调节细胞免疫功能及细胞增殖和存活方面均发挥着重要的作用。本研究采用高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒(HP-PRRSV)GD08-1株和经典株PRRSV GD-XH分别感染Marc-145细胞,于感染后不同时间提取胞浆蛋白和核蛋白,通过电泳迁移率(EMSA)检测NF-κB与DNA结合活性及western blot检测胞浆蛋白中NF-κB及其抑制因子(IκB)的表达情况。HP-PRRSV株和PRRSV经典株感染Marc-145核蛋白的EMSA结果中均出现NF-κB与DNA探针的结合条带;western blot结果表明,HP-PRRSV株和PRRSV经典株感染Marc-145细胞并未引起NF-κB表达量的变化,但两者均引起了IκB表达水平的下降,由此推测,HP-PRRSV株和经典PRRSV株感染均能够刺激Marc-145细胞NF-κB活化入核内,PRRSV感染Marc-145细胞引起的NF-κB的活化是通过IκB的降解来实现的。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,基因组结构为单股正链RNA,长约15.5 kb,含8个开放阅读框(ORF) .经典猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 以母猪发热、厌食、流产、死产、产木乃伊胎和弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征[1].