草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2（Acot2）的基因功能，并对其进行生物信息学分析，检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列（登录号：NM_001101938.1）设计引物，PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序，利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示，草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp，编码464个氨基酸，其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高（98.3%），与猕猴和黑猩猩的同源性较低（80.5%和80.4%）。Acot2蛋白分子式为C₂₃₁₇H₃₆₀₆N₆₄₀O₆₂₈S₁₄，分子质量为50.924 ku，理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50，氨基酸残基多数为亲水性残基，总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明，Acot2蛋白分布在内质网（30.4%）、线粒体（26.1%）、高尔基体（17.4%）、细胞质（17.4%）、液泡（4.3%）和细胞质（4.3%）中；磷酸化位点分析发现，Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋（21.8%）、β-转角（33.4%）、β-折叠（18.4%）和无规则卷曲（26.4%），三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示，Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高，在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性，其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定，属于水溶性蛋白，在线粒体和内质网中发挥作用，在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。     

纸皮核桃内果皮硬化期差异表达基因筛选及功能预测

【目的】综合分析纸皮核桃内果皮硬化期转录本表达情况,获得3个代表样本间差异表达基因,为系统研究纸皮核桃内果皮木质化的分子机理打下基础。【方法】采用转录组测序技术对其内果皮硬化期3个样品测序,利用生物信息学方法和软件筛选样本间的差异表达基因并进行生物学功能预测。【结果】通过Trinity软件拼接得到76 814条Unigene,筛选出了609个差异表达基因,利用Gene Ontology和KEGG数据库对差异表达基因注释,发现差异表达基因显著富集在植物激素信号转导、苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢、ABC转运子合成、泛醌和其他萜类醌生物合成等途径中。【结论】筛出了纸皮核桃内果皮硬化期差异表达基因显著富集的主要代谢途径,为今后系统研究纸皮核桃内果皮木质化的分子机理打下了良好基础。     

结缕草Zjlea3基因逆境响应模式及抗逆功能鉴定

为揭示结缕草LEA蛋白在植物逆境胁迫应答过程中的作用与功能,利用RT-PCR方法从日本结缕草Meyer中克隆得到一个lea基因,命名为Zjlea3,对其进行生物信息学分析。蛋白质理化性质分析结果表明:该基因编码产物包含177个氨基酸,预测分子质量为18.3 ku,理论等电点(pI)为5.63,为亲水性蛋白,含有9个特征性的11氨基酸基序,属于LEA蛋白中的第3组成员。聚类分析结果表明:Zjlea3蛋白与高粱、石茅等耐高温物种的同源蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示:在低温、干旱和高盐胁迫下,Zjlea3基因表达量均有上调,表达量峰值分别出现在72,24,72 h,其中受低温诱导上调幅度最大。转基因酵母抗逆性分析显示:转化Zjlea3基因的酵母细胞对冷冻、高盐和高渗胁迫的耐受能力显著提升。由此推测Zjlea3蛋白参与结缕草抵御低温、干旱和高盐等非生物胁迫的调控。     

基于II型毒素–抗毒素系统构建ε–聚赖氨酸合成酶的链霉菌稳定表达载体

鉴于ε–聚赖氨酸収酵过程对抗生素压力条件的依赖,尝试基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统(relBE2sca)构建无选择压力下稳定表达ε–聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌表达系统:将抗毒素基因relB2sca与ε–聚赖氨酸合成酶基因pls克隆至表达载体,幵导入淀粉酶产色链霉菌pls缺失突变株,将毒素基因relE2sca整合至淀粉酶产色链霉菌的染色体(突变株YY3),获得包含ε–聚赖氨酸稳定表达的突变株YY1。经过多次传代,相比对照组,在不含抗生素压力条件下,突变株YY1依然能够稳定地合成ε–聚赖氨酸。毒素蛋白RelE2sca的表达会导致变铅青链霉菌、阿维链霉菌和链霉菌FR–008等常用链霉菌异源表达宿主的死亡,提示基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统(relBE2sca)可作为一种通用的遗传标记。     

小麦TaCHS基因的克隆、表达特征及不同品种的等位变异分析

为了明确小麦查尔酮合成酶(CHS)基因TaCHS的表达规律以及挖掘TaCHS的等位变异,克隆了小麦TaCHS基因,并对其序列特征、表达特性及其在不同品种之间的多态性进行了分析。生物信息学分析表明,TaCHS基因属于多基因家族,编码的蛋白质分子质量为43.15 ku,理论等电点为6.43,属于疏水稳定蛋白,定位于细胞质中。进化分析表明,小麦TaCHS蛋白与二穗短柄草亲缘关系最为密切。TaCHS基因在根、茎、叶、籽粒中均有表达,其中在茎中表达量最高;在灌浆期,籽粒中TaCHS的表达量呈现出先升高后下降再升高的变化趋势,且在花后14 d的表达量达到第一个峰值。通过对119份小麦品种的TaCHS序列分析,发现其在不同小麦品种间的保守性较强,共发现4种变异类型,TaCHS-A1a、TaCHS-A1b、TaCHS-A1c、TaCHS-A1d分别占85.72%,7.56%,3.36%,3.36%。综上,TaCHS-A1a类型为主要的变异类型,而不同小麦品种TaCHS基因在籽粒中的表达可能与类黄酮类物质积累有关。     

拟穴青蟹Na+/H+ exchanger基因克隆及其在盐度胁迫下的表达分析

克隆了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)Na~+/H~+-exchanger基因,其cDNA序列全长3 624 bp,开放阅读框(ORF)长2 886 bp,可编码961个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kDa和7.42,具有信号肽和典型的Na~+/H~+-exchanger蛋白结构域,含12个跨膜α螺旋。拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger的氨基酸序列与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的一致度最高,达到84.9%;该基因在卵巢中表达量最高,其次是精巢、鳃等;该基因在受精卵时期表达水平最高,大眼幼体时期次之。拟穴青蟹大眼幼体在低盐(盐度7和17)胁迫过程中,Na~+/H~+-exchanger基因在20 min表达水平最高,之后基本恢复到正常表达水平;在高盐(盐度37)胁迫(20 min～2 h)期间,该基因表达水平先下降再逐渐上升。Na~+/H~+-exchanger基因在拟穴青蟹大眼幼体阶段盐度适应中发挥着重要作用,且低盐显著诱导Na~+/H~+-exchanger基因的高表达,推测拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger基因在低盐环境下发挥重要的渗透调节功能。     

NAC转录因子参与调控竹笋木质化

NAC是植物特有的转录因子家族之一，参与衰老、信号转导以及次生细胞壁合成等多种生物过程，然而关于竹子中NAC转录因子的功能尚不清楚，尤其是与次生细胞壁（SCW）合成相关的NAC更未见报道。本研究在毛竹（Phyllostachys edulis）基因组中鉴定了94个NAC同源基因（PeNAC1~PeNAC94）。系统进化树分析表明，毛竹与拟南芥的NAC蛋白共聚类为16个分支，PeNACs分布于11个分支中，其中2个分支中的15个PeNACs与次生细胞壁合成相关。用这15个基因共表达分析，预测出与PeNACs共表达的基因396个，其中包括参与木质素分解代谢和纤维素生物合成的基因分别有16个和55个。qRT-PCR分析表明，随着竹笋高度增加木质化程度加深，15个PeNACs基因的表达均上调，并呈现持续上升及先上升后下降2种趋势，表明这些PeNACs可能参与毛竹笋次生细胞壁合成以及木质化的过程。同时发现，15个PeNACs中有7个PeNACs与7个PeMYBs呈现正向共表达关系，且在毛竹不同高度笋中这些PeMYBs具有与PeNACs相似的表达趋势。另外，在16个PeNACs中发现了miR164的靶点，其中与次生细胞壁合成相关的3个PeNACs在毛竹笋中具有与miR164相反的表达趋势，证明miR164与PeNACs存在调控关系。由此表明，竹笋木质化调控将是一个由miRNA、NAC等转录因子和结构基因构成的复杂调控网络。本研究全面展示了毛竹NAC基因家族的信息及其与竹笋木质化的关系，对于进一步研究PeNACs的功能、揭示竹材材性形成的分子调控机制具有重要意义。     

大豆GmGRF5基因的组织表达模式与生物信息学分析

Growth Regulating Factor (GRF)家族基因是一类植物特有的转录因子,广泛参与植物多个重要的发育过程。为了研究大豆中的GRF转录因子的功能,本研究从大豆‘天隆1号’品种中克隆获得全长为1 038 bp的cDNA序列,由于该序列的编码蛋白与拟南芥GRF5具有高度的相似性,因此将其命名为GmGRF5基因。通过RT-PCR进行组织部位表达分析,发现GmGRF5基因在大豆各个组织部位均有表达,且在花中的表达量最高。通过ExPASy-Protparam分析发现,该蛋白质的分子量为39.463 48 kD,是具有一定亲水性、不稳定的碱性蛋白。该蛋白含有GRF家族蛋白的两个保守功能域(QLQ和WRC)。利用SOPMA对该蛋白的二级结构预测,显示其主要由无规则卷曲(72.05%)、α-螺旋(13.83%)、延伸链区(9.8%)和β-转角(4.32%)组成。此外,还利用不同的生物信息学软件对其三级结构、跨膜域、亚细胞定位、互作蛋白进行了分析,并构建系统进化树。结果表明,Gm GRF5基因在进化过程中具有高度的保守性,在大豆中具有潜在的功能多样性。