青虾源维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10-2 ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。     

1株致病性兔无乳链球菌的分离、鉴定与系统发育分析

从患病家兔肝、肺、脑和心血中分离到1株链状革兰阳性球菌P110323,以1×106 CFU/mL菌液灌胃感染健康家兔后,表现出站立不稳、四肢划动、惊厥和呼吸障碍等症状,感染96 h后,死亡率为60％.解剖见肺淤血、出血;肝、脾和肾肿大,坏死;大脑肿胀,脑膜充血,脑回肿胀扁平,脑沟变浅.分离菌在BHI平板上形成湿润、边缘整齐的灰白色菌落;在5％的脱纤维羊血平板上形成透明的β溶血环;V-P试验、水解精氨酸与马脲酸等为阳性;水解七叶苷和利用甘露醇、山梨醇和乳糖产酸为阴性.16S rDNA系统发育分析显示分离菌与Streptococcus difficilis和Streptococcus agalactiae聚在一簇.gyrB基因系统发育分析表明分离菌属于无乳链球菌(S.agalactiae),结合细菌形态特点和生理生化特性鉴定该病原菌为无乳链球菌(S.agalactiae),多重PCR方法确定该菌荚膜多糖类型为Ia型.     

矛尾复鰕虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的建立

取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106～108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

西藏低温适生芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌和促生作用

从西藏拉萨色拉寺杂草根围土壤中分离到1株低温适生芽孢杆菌LSSC3,对该菌株进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定及抗菌和促生作用研究。菌株LSSC3细胞短杆状,芽孢圆形,10℃条件下生长良好。生理生化特征显示,该菌株与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium特征一致,但ERIC-PCR指纹图谱分析表明其与B. megaterium模式菌株存在显著差异。16SrRNA基因序列分析结果显示,菌株LSSC3与B. subtilis和B. atrophaeus的系统发育相似性均很高。进一步通过gyrB基因测序和比对,其同源性与B. atrophaeus达到100%,没有找到与B. subtilis的同源性关系。据此,将其鉴定为B. atrophaeus。菌株LSSC3对植物病原真菌和细菌均具有很强的抑制作用,同时对拟南芥有良好的促生长作用。该菌具有耐低温和生防的双重特点,具有在农业生产上应用的潜力。     

gyrB基因在细菌分类和检测中的应用

gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因。综述了该基因近年来在细菌系统发育分析、细菌鉴定及临床医学应用的研究进展,并展望了其广阔的应用前景。     

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及定居因子抗原基因检测

2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。     

海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1变异菌株的特性及其抑菌作用研究

为了明确海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GM-1自发突变菌株的变异与抗菌作用的关系,进一步获得优良菌种,通过形态学观察、生理生化试验及16S r DNA和gyr B基因序列分析,对变异菌株GM-1-2特性进行分析;以8种植物病菌为供试菌,采用平板对峙法和牛津杯法分别测定变异菌株GM-1-2及其发酵液的抑菌作用;采用硫酸铵沉淀法对变异菌株产生的抑菌物质进行初步分析。结果发现,变异菌株GM-1-2的菌落形态、颜色、菌体大小与原始菌株GM-1存在明显差异,但其生理生化特性、16S r DNA和gyr B序列与解淀粉芽孢杆菌的同源性等均与原始菌株相同。变异菌株GM-1-2及其发酵液对小麦根腐病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌、大豆菌核病菌、小麦雪腐病菌、甘蓝枯萎病菌、斑点落叶病菌、黄瓜枯萎病菌的菌丝生长均有较强的抑制作用,且抑制作用明显高于原始菌株GM-1,其中菌株的抑菌带宽度提高了0.2~9.0 mm,无菌发酵液的抑制率提高了1.1%~153.7%。变异菌株的抑菌物质主要存在于硫酸铵沉淀中,沉淀后的上清液无明显的抑菌作用。以上结果表明,变异菌株GM-1-2的抑菌活性提高,其产生的抑菌物质与原始菌株存在差异,具有潜在的开发价值。     

金黄色葡萄球菌氟喹诺酮的耐药性与gyrA、gyrB突变的关系研究

为了探讨金黄色葡萄球菌对氟喹诺酮耐药性与gyrA、gyrB突变的关系，本研究对氟喹诺酮敏感金黄色葡萄球菌进行耐药诱导，获得一系列不同氟喹诺酮耐药水平的人工诱导耐药菌，应用PCR扩增野生菌和人工诱导菌的gyrA、gyrB基因并测序，经核苷酸和氨基酸序列分析表明：氟喹诺酮耐药菌的gyrB基因无突变，氟喹诺酮耐药菌的gyrA有Ser85→Leu和Ser84→Pro的突变。实验结果表明：gyrA突变是金黄色葡萄球菌氟喹诺酮耐药水平增高的主要原因。