草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

赤眼鳟与草鱼TLR19结构及功能差异初探

为探索赤眼鳟TLR19(ScTLR19)与已报道草鱼TLR19(CiTLR19)的结构及功能差异，实验克隆了ScTLR19基因全长并分析其结构特点，利用实时荧光定量PCR(qPCR)分析其组织表达及草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染后的表达特征，同时采取过表达实验揭示其对TLR19信号通路下游功能基因的激活特性。结果显示，ScTLR19基因编码957个氨基酸，与CiTLR19氨基酸序列具有高度相似性(94.04%)；但ScTLR19胞外区由9个亮氨酸重复序列(LRR)组成，比CiTLR19在654~677氨基酸位点之间明显多1个LRR，且在三级结构上相应多2个α-螺旋和6个β-折叠。ScTLR19广泛表达于赤眼鳟各组织，GCRV攻毒后，其表达水平在免疫组织肾脏中显著上调。赤眼鳟鳍条细胞系过表达ScTLR19并接受GCRV攻毒后，干扰素调节因子IRF7在攻毒期间的表达水平与对照组无显著差异，而干扰素调节因子IRF3在攻毒12和24 h的表达水平显著上调，且衔接蛋白MyD88和TRIF的表达水平均显著上调。研究表明，与CiTLR19相比，ScTLR19同样只对IRF3而不对IRF7进行调控，但不同于CiTLR19单一调控TRIF的模式，其同时对MyD88和TRIF二者进行调控，可能介导更多样的抗病毒免疫反应。     

草鱼呼肠孤病毒097株L3、M5和S8片段部分编码区的克隆与分析

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)可以引发草鱼出血病,给我国淡水渔业造成严重经济损失。GCRV基因组由11个分节段双链RNA组成,研究克隆了GCRV-097株的L3、M5和S8三个片段的部分编码区(CDS)序列,其中L3片段长度为675bp(JQ782741),M5片段长度为777bp(JQ782742),S8片段长度为785bp(JQ782743)。同源性比较分析发现,GCRV-097株L3、M5、S8片段与GCRV-II型的代表株GCRV-HZ08相应区域的相似性分别为99.7%、99.4%、89.6%,表明GCRV-097株属于GCRV-II型。该结果为研究GCRV-097病毒株的生物学特性奠定基础,为进一步研究鱼类抗病毒疫苗提供一定的理论依据。     

草鱼C5a、C5aR和FⅡ多克隆抗体的制备与表达特性

为研究草鱼补体蛋白5a (complement component 5a,C5a)、补体蛋白5a受体(C5a receptor,C5aR)和凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ,FⅡ)在感染草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)时的蛋白表达和相互作用,针对草鱼C5a和FⅡ蛋白构建了原核表达体系、针对草鱼C5aR蛋白构建C5aR-KLH偶联物,纯化蛋白,免疫日本大耳白兔制备3种蛋白的多克隆抗体。用蛋白质印迹(Western blot)、免疫共沉淀(Co-IP)和拉下(pull down)实验检测3种蛋白表达与互作关系,Western blot结果显示,C5a和C5aR在健康草鱼的肝脏、脾脏、肾脏、头肾、肠、鳃和肌肉中均有蛋白表达,FⅡ在肝脏、脾脏和肠中表达,而在肾脏、头肾、鳃和肌肉中不表达;在感染GCRV的草鱼肝脏组织中C5a、C5aR和FⅡ蛋白均随病程进展呈现上升趋势。Co-IP结果显示,在GCRV处理后,C5a、C5aR和FⅡ蛋白具有相互作用关系。pull down结果显示,C5a pull down共鉴定得到C3、RIG-I等2...     

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。     

碘伏对三种水生动物病毒的杀灭效果

测定了碘伏消毒液对三种感染水生动物的病毒的杀灭作用和一些因素对碘伏消毒液消毒效果的影响。结果显示,含有效碘浓度为５ｍｇ／ｌ的消毒液室温下处理５分钟,可灭活滴度为１０７５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ的草鱼呼肠孤病毒和１０７０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ的病毒性出血败血症病毒;含有效碘浓度为５０ｍｇ／ｌ的消毒液可灭活滴度为１０５７５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ的甲鱼虹彩病毒。细胞培养液中的有机成分对碘伏消毒液中有效碘浓度有较大的影响;酸碱度６～９之间,碘伏消毒液中有效碘浓度没有明显变化。     

草鱼呼肠孤病毒纤维蛋白VP56与草鱼GRP78蛋白互作诱导内质网应激

为了阐明草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的感染机制，深入探究VP56 (Ⅱ型和Ⅲ型GCRV特有的纤维蛋白)与宿主细胞蛋白的相互作用。实验通过免疫共沉淀(co-IP)发现，VP56与细胞内定位于内质网的分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)发生相互作用。而后，VP56与GRP78的互作通过基于远红外红色荧光蛋白mNeptune的双分子荧光互补系统(BiFC)得到验证。在VP56稳定表达的草鱼肾细胞系(CIK)中，相较于CIK细胞，内质网则形态发生巨大变化，产生肿胀、扩张、脱粒等现象，说明VP56激活内质网应激。通过对内质网应激下游转录因子的mRNA水平检测，发现VP56激活活化转录因子6 (ATF6)介导的信号转导途径，激活非折叠蛋白反应。研究表明，GCRV-Ⅱ感染过程中破坏了细胞稳态、激活内质网应激。本研究为GCRV感染机制和抗GCRV病毒研究提供了新思路，揭示了一种新的病毒逃逸机制，有助于淡水养殖产业中草鱼出血病的防控。     

GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性

为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平。结果显示,经GCRV弱毒疫苗免疫的草鱼母本血液、早期胚胎及幼鱼阶段IgM蛋白活性均显著高于对照组样品。子代各阶段中,28日龄的夏花样品IgM蛋白活性水平最高,而5日龄水花样品中蛋白活性最低;从受精卵发育至3日龄水花阶段,实验组样品免疫因子C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组;2组鱼中IgM、C3和LSZ蛋白的活性水平随着发育进行,总体上呈先下降后升高的趋势,从卵细胞至3日龄水花阶段实验组样品C3和LSZ蛋白活性水平均显著高于对照组。实验组和对照组受精卵IgM基因的表达水平差异最大,实验组表达量为对照组的3.4倍。从24 h器官形成期至3日龄水花样品中,实验组C3基因的表达水平显著高于对照组。从卵细胞至3 h囊胚期阶段,实验组LSZ基因表达水平显著高于对照组。实验组2月龄草鱼体肾、头肾、脾脏组织中IgM基因表达量均显著高于对照组;感染GCRV病毒后,实验组死亡尾数(2尾)低于对照组死亡尾数(5尾)。研究表明母源性免疫可在草鱼进行代间传递,并对子代起到一定程度的免疫保护作用。     

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

为研究II型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)病毒样颗粒(viruses-like particles, VLPs)疫苗,本试验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)将编码VP35蛋白的GCRV-S11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA^TM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,本试验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)进行检测。结果显示,GCRV的3个蛋白在sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径大小为65-72nm。本试验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型自然发病与人工注射感染草鱼的病理症状和病毒分布研究

为了探究自然发病和人工注射感染草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型(GCRV-Ⅱ型)草鱼的临床症状、病理特征和病毒分布的区别，实验采用临床剖检、组织病理学观察、分子生物学检测、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)等检测方法开展实验，通过对自然发病和人工注射感染草鱼的临床症状进行比较，结果显示，患病草鱼的眼眶、鳃盖、口腔、腹部、鳍条基部、肠道、肌肉出现明显的点状出血，且后者的出血情况比前者更为严重；比较组织病理切片，发现草鱼感染组织出现不同程度的充血和红细胞充盈现象，其中，人工注射感染草鱼的肠道、肌肉和肝胰脏的病变程度更为严重，呈现出较为严重的组织内出血和病变，而自然发病草鱼的鳃和脾脏的病变程度更为严重，鳃呈现出较为严重的充血和炎症增生物，脾脏出现大面积含铁血黄素沉积块病灶。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，GCRV在不同的组织中均有分布，头肾在两种感染方式的患病草鱼中的病毒量都比较高，人工注射感染草鱼的肝胰脏、肠道和肌肉的病毒量较高，自然发病草鱼的中肾、鳃和脾脏的病毒量较高。因此，在人工注射感染时，肝胰脏、肠道和肌肉可能是GCRV入侵的主要靶...