拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域的可溶性表达与纯化

大肠杆菌NusA蛋白与拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLAVATA1(CLV1)胞外结构域(Ectodomain,ECD)融合表达,实现了蛋白CLV1-ECD的可溶性表达;CLV1-ECD与其配体蛋白CLAVATA3(CLV3)共表达,可以明显提高它的水溶性。该实验方法快速简易地获得了大量纯化的CLV1-ECD蛋白,避免了包涵体变性与复性的复杂过程,为植物CLAVATA信号系统的进一步研究奠定了基础。     

水稻白叶枯病菌HD-GYP结构域蛋白PXO_03945的功能鉴定

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号相关蛋白PXO_03945的生物学功能,本研究通过基因同源重组和无标记交换,对PXO_03945基因进行了缺失突变,对野生型、突变体和互补菌株进行表型测定,分析该基因缺失突变对病菌胞内c-di-GMP水平、致病性、运动性、胞外多糖产生和生物膜形成的影响。结果表明,PXO_03945蛋白具有参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶(PDE)的HD-GYP结构域和功能未知的DUF3391结构域。全长基因缺失可导致体内c-di-GMP浓度明显上升。与野生型相比,ΔPXO_03945对水稻品种日本晴的致病性显著下降,而游动性增强,胞外多糖产生和生物膜形成增加。基因互补可以使之恢复。因此,HD-GYP结构域蛋白PXO_03945可能通过降解胞内c-di-GMP,正向调控了致病性,负向调控了运动性、EPS产生和生物膜形成能力。     

甘薯等10种作物基因的生物信息学分析

采用生物信息学相关软件对甘薯等10种NAC1蛋白的氨基酸序列及其理化性质、磷酸化位点、疏水性或亲水性、二级结构和三级结构、跨膜结构域、信号肽、亚细胞定位以及保守结构域等进行了预测和分析。结果表明:供试10种NAC1蛋白的磷酸化位点主要为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸;这些NAC1蛋白均为亲水性蛋白,属于非分泌蛋白,不具有信号肽,没有明显的跨膜结构域;在它们的二级结构中,无规则卷曲所占比例最高;MtNAC1和CaNAC1可能定位于叶绿体,NtNAC1和GmNAC1可能定位于线粒体,甘薯及其他6种作物的NAC1蛋白可能定位于细胞核;甘薯等NAC1蛋白的三级结构与水稻NAC1蛋白具有一定的相似性;10种NAC1蛋白均含有1个NAM(No apical meristem)功能结构域。氨基酸序列比对和进化树分析显示IbNAC1与CaNAC1的亲缘关系最近。     

柱型苹果MdCoLBD1/2基因生物信息学及SNP分析

柱型苹果(Columnar apple)是苹果株型育种的珍贵资源.利用同源基因克隆方法,以柱型苹果"威塞克旭"一年生枝上休眠期芽cDNA为模板,克隆得到了LOB DOMAIN家族(LBD)的2个同源基因,命名为MdCoLBD1/2,分别编码195和240个氨基酸.该基因有LBD家族的典型结构域,如C盒、GAS盒、亮氨酸拉链(Leu zipper)结构以及LOB Domain区域等.MdCoLBD1/2分别定位于第10条染色体Chr10:18985568..19005801和MdCoLBD2 Chr10:18985594..19005850区间.MdCoLBD1/2与白梨、葡萄、草莓、椰子、梅、核桃的氨基酸的相似性均在60%以上.聚类分析表明MdCoLBD1和白梨、梅、草莓亲缘关系较近,MdCoLBD2与葡萄、核桃亲缘关系较近,MdCoLBD1/2与亚洲棉、陆地棉的聚类关系均较远.通过测序分析了MdCoLBD1/2基因在30个不同类型材料中的碱基序列差异,得到MdCoLBD1有8个碱基差异位点,MdCoLBD2有5个碱基差异位点.     

桉树焦枯病菌ABC转运蛋白的鉴定与分析

[目的]利用生物信息学方法探讨ABC转运蛋白在焦枯病菌对桉树侵染过程中的解毒作用,为揭示桉树焦枯病致病机制奠定基础。[方法]本文利用BLAST、HMMER、Pfam数据库、TCDB数据库在全基因组内对桉树焦枯病菌的ABC转运蛋白进行鉴定和分类,并通过Prot Camp和IBS分别进行亚细胞定位和结构域图绘制,依据同源性对其功能进行推测分析。[结果]表明:桉树焦枯病菌共有70个ABC转运蛋白,它们分属于8个亚族。71%的转运蛋白位于细胞膜,10%位于液泡,其余部分位于线粒体、过氧化物酶体、内质网等内膜系统上。桉树焦枯病菌ABC转运蛋白包含全分子、四分之三分子、半分子及四分之一分子。根据同源性推测桉树焦枯病菌ABC转运蛋白与MDR、PDR、HMT、MPE、STE、P-FAT等几种转运蛋白具有较高相似性,同时还与核糖体合成、翻译、过氧化物酶体合成的ABC转运蛋白具有较高相似性。[结论]桉树焦枯病菌ABC转运蛋白除作为外排泵转运外源化学物质、疏水性化学分子等物质。还参与细胞代谢、翻译、核糖体的合成、mRNA的输出、β氧化,并通过为辅酶Q的辅助因子增强呼吸代谢等多项生命活动为焦枯病菌的侵染提供能量。     

含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析

利用电子克隆和RT-PCR技术,在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因,暂命名为TaCDCP1(Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框,编码217个氨基酸。推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域,不含跨膜区且无信号肽,定位在叶绿体基质内;经过同源比对,小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高;该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中;在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中,TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导,分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰,非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合,而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合;外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达,苄基腺嘌呤,乙烯,赤霉素,茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制;TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升,在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应,同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。这些结果对于明确CBS结构域的功能以及CBS结构域蛋白尤其是TaCDCP1在小麦与条锈菌互作中的作用奠定了基础。     

4个物种CCT结构域基因家族的序列进化分析

通过分析4个完成测序和注释的植物基因组,系统地分离鉴定了97个水稻、玉米、高粱和拟南芥的CCT结构域基因,并对相应蛋白质的结构和基因之间的系统演化关系进行了分析。结果表明:CCT结构域基因的蛋白质结构和特性在不同物种之间具有广泛的变异;不同基因组中CCT结构域基因通过染色体复制扩展了基因家族成员。根据其CCT结构域分为4组,其中1个亚组集中了绝大部分的禾本科CCT结构域基因,该亚组基因可能特异参与了禾本科作物开花时间的调控。基因家族成员的扩展,蛋白质结构的改变以及基因表达模式的变异共同导致了CCT结构域基因家族成员在物种间和物种内的功能分化。     

玉米大斑病菌Velvet基因家族生物信息学分析

采用生物信息学方法对玉米大斑病菌Velvet基因家族成员进行序列鉴定,并从理化性质、保守结构域、二级及三级结构以及功能域等方面进行预测和分析。结果表明,该家族各成员无信号肽结构。玉米大斑病菌Velvet家族基因与其他植物病原真菌Velvet家族基因具有较高同源性。该家族成员具有典型的Velvet超家族保守结构域。二级结构分析结果显示,该家族各成员蛋白质的结构元件均主要由无规则卷曲构成。家族成员可能通过可逆磷酸化在植物病原真菌的次生代谢中发挥作用。上述结果为进一步研究Velvet基因家族在植物病原真菌次生代谢中的作用打下了基础。     

美国白蛾hcapn3基因的克隆及HcAPN3蛋白与Cry1Ac结合特性分析

通过比对分析已知昆虫氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)氨基酸序列并结合本实验室的美国白蛾(Hyphantria cunea)中肠iTRAQ结果,设计了hcapn3基因特异引物,获得hcapn3基因片段。通过RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因(hcapn3)全长序列(GenBank登录号为KJ013598)。Blastp分析表明,获得的氨肽酶属于氨肽酶N3家族,命名为HcAPN3。序列分析显示HcAPN3包括952个氨基酸残基,具有典型的谷氨酸锌化氨肽酶(Gluzincin)结构域和羧基端(ERAP1_C)结构域。利用Bac to Bac表达系统在昆虫细胞中表达108kDa的HcAPN3蛋白。在原核表达系统中表达58kDa的Gluzincin结构域和49kDa ERAP1_C的结构域蛋白。Ligand Blot分析结果显示,HcAPN3蛋白及Gluzincin结构域可与Cry1Ac蛋白特异性结合,但ERAP1_C结构域未能与Cry1Ac结合。本研究首次克隆了美国白蛾氨肽酶基因并分析了HcAPN3与Cry1Ac的结合特性,为下一步功能研究提供基础。     

参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶基因分析

为了解参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases in Bemisia tabaci,Bt CLIPs)基因,对已鉴定的8个Bt CLIPs基因编码的蛋白进行序列分析,与冈比亚按蚊、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾4种模式昆虫的同源蛋白进行系统进化分析,并通过q RT-PCR检测球孢白僵菌侵染烟粉虱4龄若虫后Bt CLIPs的时间表达模式。结果显示,8个Bt CLIPs基因均为含有CLIPs结构域的丝氨酸蛋白酶基因;Bt CLIP19、Bt CLIP20和Bt CLIP21独自聚在进化树的一支上;其它Bt CLIPs均与4种模式昆虫中的1种或多种同源蛋白聚在一起;与对照相比,8个Bt CLIPs基因受球孢白僵菌侵染后在不同时间的相对表达量均上调,但诱导程度不同,48 h的相对表达量达最高,其中Bt CLIP19上调表达最明显,为对照组的71倍。研究表明,8个Bt CLIPs可能参与烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,并成为烟粉虱生物防治的新靶标。