C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位对PCV2 VLPs稳定性的影响

【目的】利用大肠杆菌原核表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及在其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap嵌合蛋白,对Cap蛋白形成的病毒样颗粒（VLPs）的稳定性、免疫原性以及C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位VLPs的热稳定性进行研究,为猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs疫苗的高效制备及基于Cap VLPs纳米骨架展示技术嵌合疫苗的开发奠定基础。【方法】采用分子生物学方法合成PCV2b型强毒株ZJ的cap基因,在其C-端插入PRRSV T细胞抗原表位T1、T2、T3、T4、T5,构建cap-T1～cap-T5基因;将cap及cap-T1～cap-T5基因与pET28a表达载体连接,构建重组表达载体,转染大肠杆菌ClearColi^TMBL21(DE3)进行诱导表达,并对表达产物的热稳定性及免疫效果进行检测。【结果】实现了Cap蛋白及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并成功观察到了VLPs;表达产物热稳定性分析显示,在60 ℃处理30 min条件下,Cap VLPs保持稳定,而C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的VLPs热稳定性大幅下降;小鼠免疫效果检测显示,Cap VLPs诱导产生了高水平特异性抗体,其中VLPs+佐剂S350组效果最好。【结论】利用大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白可高效自组装成耐热和高免疫原性的VLPs,但在Cap蛋白C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位后的嵌合VLPs组装效果和稳定性急剧下降,提示PCV2 VLPs作为纳米骨架用于传染病疫苗研发仍有较大局限性。     

Gene cloning of porcine adiponectin gene from adipose tissue and construction of its eukaryotic expression vector

To clone adiponectin (ADPN) gene from Shaziling porcine adipocyte and construct its eukaryotic expression vector, total RNA was extracted from subcutaneous fatty tissue. One pair of specific primers was designed by Primer 5.0 software according to the sequence of ADPN gene of porcine available in GenBank. The ADPN gene was amplified by PCR from cDNA and cloned into pMD18‐T vector to construct recombinant clonal vector pMD‐ADPN, sequenced and analysed. A recombinant expression plasmid pPICZaA‐ADPN was constructed by subcloning the cloned ADPN gene into the linearized pPICZaA vector. Then, the plasmid pPICZaA‐ADPN was expressed in Pichia pastoris (GS115) by electrotransformation. Western blot and Bradford analysis were used to determine the target protein induced by methanol. Results showed that the genome size of ADPN was 732 bp and encoded 244 amino acid, the nucleotide sequence of ADPN shared 100% identity with that of porcine available in GenBank. Western blot and Bradford analysis showed that the recombinant ADPN was expressed in GS115 correctly and has certain immune activity. The expression level of ADPN was 28.5 μg/ml. In conclusion, the recombinant ADPN could express in eukaryotic expression vector pPICZaA‐ADPN constructed in this study effectively.     

猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长,感染后0～8h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8～36h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3％是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。     

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立

为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光（IFA）的符合率为85.53%（130/152）,与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%（134/152）。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。     

2012―2013年猪繁殖与呼吸综合征病毒河南流行株的分离鉴定及分子流行病学调查

为了解河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异情况和发展趋势。通过RT-PCR方法,对2012―2013年采自河南省各地疑似病料进行PRRSV检测,并对阳性病料进行病毒分离鉴定及分子流行病学分析。结果显示：54份疑似病料中17份检测为阳性,阳性率为31.5%,并分离出3株PRRSV;通过完整的ORF5基因和部分NSP2基因序列遗传进化分析表明,河南地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且17份阳性样品中10份与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）高度同源、2份与经典PRRSV高度同源、另外5份与美洲流行毒株NADC30高度同源,该类毒株的NSP2基因在不同部位存在393个核苷酸缺失,国内尚未见相关报道。结果表明,2012―2013年河南地区PRRSV主要流行毒株为HP-PRRSV,同时出现了新的变异毒株,使河南地区乃至我国PRRSV变异种类更加多样化,提示加强PRRSV流行及变异的监测十分必要。     

猪α-干扰素表达系统及其应用的研究进展

就猪α-干扰素的分子特征、生物学特性、表达系统和猪基因工程α-干扰素的应用进行综述,以期为猪α-干扰素在广谱抗病毒活性、抗肿瘤以及免疫调节的临床应用提供参考。     

国内商品化猪圆环病毒疫苗的现状及展望

截至2013年12月份,已有16家企业6种不同的猪圆环病毒2型灭活疫苗获得了农业部的注册,其中有批签发的企业14家。整理了猪圆环病毒疫苗在我国的商品化情况,分类总结了该类疫苗工艺核心等基本情况,同时分析了猪圆环疫苗的优缺点,并对猪圆环病毒疫苗的发展前景进行了展望。     

猪圆环病毒病原学研究进展

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)有2种不同的血清型,即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。目前研究表明PCV1暂无致病性,但PCV2则被认为是引起猪圆环疾病(PCVDs)的主要病原。很多地区养猪业的经济效益因此而遭受了重大的影响。PCV现已受到全球的关注,引起了许多专家学者的高度重视。本文对PCV的病原学最新研究进展进行了综述。     

2株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及ORF3基因的克隆与序列分析

为研究、防控广东地区猪流行性腹泻,首先通过RT-PCR法确定某猪场粪便样品中存在猪流行性腹泻病毒,随后利用Vero细胞进行盲传,最后经核酸类型鉴定、RT-PCR、病毒TCID50的测定、目的基因测序和序列分析等方法,确认分离到2株猪流行性腹泻病毒毒株,命名为PEDV GDKP-2013和PEDV GDKP2-2013,通过ORF3全基因核苷酸序列分析可知,GDKP-2013株与GDKP2-2013株与经典参考毒株的氨基酸序列一致性为 JX261936-CHGD-01,98.2%,98%;JQ039903-CH-GD-2011,98.6%,98.4%;AF353511-CV777,95.4%,95.1%;KC344845-STPED0810,95.1%,94.8%;EU054929-DR13,95.5%,95.2%;KF272920-USA-Colorado-2013,95.1%,94.8%,表明此2毒株与国内分离株的氨基酸同源性高,与韩国、泰国和美国分离株的氨基酸同源性要低一些,同时,与疫苗参考株的氨基酸同源性也相对较低;基因系统进化分析可知,GDKP-2013株与GDKP2-2013株主要处在Ⅰa分支,均与弱毒疫苗株（Ⅰb分支）相互之间遗传进化关系较远。