RT-PCR结合限制性内切酶分析法区分NDV强弱毒株

通过设计的特异引物，采用RT-PCR对1996年以来分离的45株国内新城疫病毒分离株进行鉴定和分析，并与其MDT实验结果进行比较，建立了RT-PCR结合BglⅠ内切酶分析区分新城疫强弱毒的方法。此方法操作简便、迅速，不仅能区分新城疫的强弱毒株，还可诊断AMPV-1引起的其他禽类的感染。     

Identification of divergent variants of Grapevine virus A

Eight isolates of Grapevine virus A (GVA), which induced different symptoms in leaves of Nicotiana benthamiana, were recovered from various grapevines. The dsRNA patterns of two isolates, which consistently induced mild vein clearing (referred here as mild isolates of GVA) were similar, but different from those of other isolates of GVA. Analysis based on overall nucleotide (nt) sequence identity in the 3 terminal part of the GVA genome, comprising part of ORF3 (putative movement protein, MP), entire ORF4 (capsid protein, CP), entire ORF5 and part of 3 UTR, revealed that GVA isolates separate into three groups (I, II, III), sharing 91.0–99.8% nt sequence identity within groups and 78.0–89.3% nt sequence identity between groups. Mild isolates of the virus were group III and shared only 78.0–79.6% nt sequence identity with the other isolates. The comparison of predicted amino acid sequences for MP and CP revealed many amino acid alterations, revealing distinct local net charges of these proteins for mild isolates of the virus. Based on both conserved and divergent nt regions in the CP and ORF5, oligonucleotide primers were designed for the simultaneous RT-PCR detection of all GVA isolates and for the specific detection of the most divergent virus variants represented here by mild isolates of the virus.     

腹水综合征肉鸡肺脏缺氧诱导因子-1α基因克隆及表达研究

从21日龄患腹水综合征（AS）鸡肺脏中提取RNA,根据健康鸡胚心室肌细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因序列（登录号为NM204297）设计引物,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收后与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序.结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为1 576 bp.序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与鸡胚HIF-1α cDNA和氨基酸序列同源性分别为99%和98%.采用RT-PCR技术检测4只21日龄正常肉鸡和4只21日龄AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡（P《0.01）.本试验证明,HIF-1α与肉鸡肺动脉高压导致的腹水综合征相关.     

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒（AVAV）内蒙古分离株（C-98株）总RNA，参考GenBank中禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列设计了2对引物，应用RT—PCR技术扩增了病毒S1基因，将S1基因cDNA克隆到pGEM—T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV—YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示，AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高，达99．9％；与MDRV—YJL的同源性为99．3％，与弱毒疫苗株ARV—S1133的同源性也达97．9％；与ARV-138株的同源性最低，为81．2％。表明，AVAVC-98株与参考毒株的差异较小，与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

禽流感病毒和新城疫病毒二联RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据禽流感病毒M蛋白基因和新城疫病毒NP基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为600bp和340 bp。通过对相关病毒检测,建立了AIV和NDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为AIV和NDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。     

淫羊藿苷对大鼠腺垂体细胞合成分泌CTH的影响

通过腺垂体细胞的原代培养技术和半定量RT-PCR技术观察淫羊藿苷对大鼠腺垂体合成分泌GTH的影响。建立了腺垂体细胞总RNA的提取、FSH和LH特异基因的PCR扩增的体系和条件,并以β-actin为内参照与FSH和LH特异基因进行多重比较。结果淫羊藿苷能提高大鼠腺垂体细胞中GTHmRNA的水平,但并非与剂量呈线形关系,中剂量组(60μl/l)时大鼠腺垂体细胞中GTHmRNA的水平最高,与低剂量组(30μl/l)和高剂量组(100μl/l)差异显著。表明淫羊藿苷不但能通过直接作用与性腺来发挥“壮阳”的作用,而且其对垂体细胞也有刺激作用。