2013～2014年猪嵴病毒分子检测和3D基因遗传变异分析

[目的]为调查猪嵴病毒（ PKV）在我国哺乳仔猪中的流行和变异情况。[方法]采集2013～2014年我国5个省份27个猪场224份哺乳仔猪腹泻粪样,采用 RT-PCR方法对 PKV的3D基因进行检测,并对其中的29个 PKV 3D基因进行序列测定和遗传变异分析。[结果]腹泻粪样中PKV总阳性率为65.18％（146/224）,猪场PKV总阳性率为85.2％（23/27);29个 PKV 3D基因与国内外6株其他 PKV株相关序列的核苷酸同源性为87.0％～100％,所推导的氨基酸序列同源性为92.7％～100％。[结论]我国哺乳仔猪中普遍存在 PKV感染,PKV 3D基因呈现多样性。     

Detection of novel kobu-like viruses in Japanese black cattle in Japan

During surveillance for bovine diarrhea of unknown causes in Japanese black cattle in Kagoshima Prefecture, Japan, we found two types of novel kobu-like viruses in fecal samples of calves. Sequence analyses revealed that they had L protein and 2A protein with H-box/NC sequence motif, which are present in kobuviruses. Phylogenetic analysis revealed that they were related to kobuviruses; however, they clustered apart from other kobuviruses. In the prevalence study of two types of novel kobu-like viruses, 16.9% and 10.4% prevalence of these viruses were observed in the feces of diarrheal calves in this area.     

猪嵴病毒病原特性及检测技术研究进展

猪嵴病毒（porcine kobuvirus,PKV）是近年来在健康猪和腹泻猪粪便中新检测到的小核糖核酸病毒科嵴病毒属成员,可能引起猪的腹泻,对养猪业造成重大经济损失。研究发现,PKV广泛分布在猪中,在腹泻和临床健康猪中均已被检测到,阳性率从3.9%~100.0%各不相同。一个典型的PKV病毒粒子直径为30 nm,基因组全长为8 120 bp,包括1个含2 488个氨基酸的开放性阅读框（ORF）;PKV是典型的小RNA病毒科的基因组结构：1个5'非编码区,1个L蛋白,结构蛋白P1（VP0、VP3和VP1）,非结构蛋白P2（2A、2B和2C）和P3（3A、3B、3C和3D）,1个3'非编码区和1个Poly（A）尾巴。PKV的2B编码区存在30个氨基酸的缺失,VP1蛋白是小RNA病毒科变异最频繁的结构蛋白,其含有主要的抗原表位,可促进机体产生中和抗体。检测PKV的方法有反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR和逆转录环介导扩增（RT-LAMP）方法。作者对PKV的分类学、流行概况、基因组结构、遗传特性及检测技术等研究现状做一简要概述,以期为进一步研究及了解PKV提供参考。     

猪嵴病毒PCR检测方法的建立及其应用

本研究根据GenBank上猪嵴病毒核苷酸序列设计了一对特异性引物,建立猪嵴病毒的PCR检测方法。该方法特异性强,敏感度高,重复性好。应用该PCR方法对2010年在上海周边地区采集的116份猪粪样品进行检测,结果45份为猪嵴病毒阳性,表明上海地区猪群中猪嵴病毒相当流行。本研究建立的PCR方法可以用于猪嵴病毒的流行病学监测。     

猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示,猪库布病毒在猪群中集中分布在发生腹泻疫情的猪群,说明猪库布病毒和现阶段的腹泻疫情有紧密的联系。     

猪嵴病毒VP0基因的克隆与序列分析

本研究根据猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)VP0基因序列特征设计特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒VP0基因全长编码区。将特异性扩增目的片段克隆后进行序列测定,将结果进行拼接后获得猪嵴病毒VP0基因全长并进行相关生物信息学分析。所扩增的目的片段编码有完整的VP0基因开放阅读框,全长为1 098 bp,编码有366个氨基酸,理论等电点为6.71,理论分子质量为38.489 ku,不稳定系数为34.65,最大疏水指数为2.622,最小疏水指数为-2.122。将获得的VP0基因和GenBank中的猪嵴病毒代表株VP0基因序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化分析,其与HNXX-4核苷酸同源性最高,为89.1%,与S-1-HUN核苷酸同源性最低,为81.1%。从遗传进化上看,猪嵴病毒VP0基因在遗传进化上呈两个独立的基因亚群,猪嵴病毒中国分离株在两个遗传基因亚群上均有分布。     

Cloning and Sequence Analysis of the VP0 Gene of Porcine Kobuvirus

In this study, specific primers were designed according to VP0 gene of porcine kobuvirus (PKV), and the full-length coding region of VP0 gene was amplified by RT-PCR method and sequenced, then bioinformatics analysis were conducted to investigate the structure and function of the porcine kubovirus VP0 gene.The results showed that the porcine kobuvirus VP0 gene was 1 098 bp in length, coding an open reading frame (ORF) with 366 amino acids.The isoelectric point, molecular weight and instability index of porcine kubovirus VP0 were 6.71, 38.489 ku, 34.65, respectively.The maximum and minimum hydrophobicity were 2.622 and —2.122, respectively.Compared with the porcine kubovirus VP0 genes published previously in GenBank, the sequenced gene shared the highest homology with HNXX-4 strain, which was 89.1%;And shared the lowest homology with S-1-HUN strain, which was 81.1%.The porcine kubovirus VP0 gene shared two different phylogenetic genotype branches, and the Chinese porcine kubovirus isolates distributed in the two phylogenetic genotype branches.     

猪嵴病毒VP1基因序列测定与分析

[目的]对猪嵴病毒(PKV) VP1基因进行测序与同源性分析,确认其可能来源,为今后的生物学特性分析及仔猪腹泻防治工作提供科学依据.[方法]采用RT-PCR对GXPKV-1毒株VP1基因进行克隆,运用DNASTAR软件包中Megalign程序对测序获得的VP1基因进行核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性分析.[结果]GXPKV-1毒株ⅥP1基因全长762 bp,共编码254个氨基酸,与GenBank已公布的13株参考毒株VP1基因的核苷酸同源性为74.1%~85.4%,推导氨基酸同源性为81.1%~93.3%.根据VP1基因推导氨基酸序列进行系统发育进化分析,发现GXPKV-1毒株与Gansu-2012、JS1419等国内参考毒株同属于同一亚群,而与瑞士分离株Swine-S-1-2007、泰国分离株THA-2008、美国分离株H24-2012-USA及四川分离株CHN-SC-2011-02等的亲缘关系较远.[结论]猪嵴病毒GXPKV-1毒株起源于国内流行毒株的传播,在新的环境下虽然其VP1基因核苷酸发生变异,但由于同义翻译,推导氨基酸的同源性仍然较高,说明碱基突变并未引起蛋白结构的改变.     

猪嵴病毒3C蛋白的原核表达及其结构分析

为获得猪嵴病毒3C蛋白并了解其晶体结构,本试验以中国西北地区猪嵴病毒swKoV CH441株RNA为模板,通过RT-PCR克隆出3C基因,将其连接到pMD19-T Simple Vector,通过PCR和双酶切鉴定后进行基因序列测定。选择测序正确的质粒经双酶切获得目的片段并将其连接到pET-30a载体以构建重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,检测3C蛋白的表达情况。结果显示,本试验成功获得全长为576 bp的3C基因,可编码192个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组菌在37℃经0.5 mmol/L IPTG诱导6 h时重组蛋白表达量最高,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为28 ku。生物信息学分析结果显示3C蛋白为不稳定的非分泌蛋白,没有跨膜区,有多个磷酸化位点,主要参与蛋白水解过程,不同嵴病毒株间3C序列差异较大。3C蛋白作为小RNA病毒的共同裂解酶,在病毒复制、转录、翻译及多聚蛋白成熟过程中起着极为重要的作用。本研究成功构建了3C蛋白原核表达载体并对其结构进行了预测为进一步制备猪嵴病毒3C蛋白晶体及研究其结构奠定了基础。