鳜浸泡嗜水气单胞菌全菌疫苗后皮肤黏液抗体的变化

应用间接ELISA方法,研究经嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)疫苗浸泡免疫后鳜(Siniperca chuatsi)皮肤黏液中抗体消长规律,以揭示鳜局部黏膜免疫在免疫保护中的作用及浸泡免疫的保护效果。结果表明,鳜皮肤黏液中抗体滴度在免疫后第7天达到峰值211,抗体从开始形成到消失持续21 d;添加佐剂(IMS1312、葡聚糖、莨菪碱、食盐)可以提高鳜皮肤黏液及血清中抗体滴度和相对免疫保护率,其中添加IMS1312组免疫保护率最高,达77.8%,免疫保护与抗体滴度成正相关(R2=0.79,P<0.05);以溶菌酶为代表的非特异性免疫在免疫后1周内即抗体未形成时,对鱼体起主要保护作用。此外,通过比较鳜血清与皮肤黏液中的抗体消长规律,发现血清中抗体滴度峰值出现时间较迟(第14天),抗体持续时间较长(42 d),初步推断鳜皮肤黏膜中可能存在相对独立于全身免疫系统的局部黏膜免疫系统。     

嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析

利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了AHYT—1和AHl05012株嗜水气单胞菌的菌体单抗，筛选出11个能稳定分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的细胞株，并对这些单抗进行了特性分析。经单抗类型测定，这些单抗分属IgM、IgG2a2个亚类，且均具有ELISA反应特性，腹水抗体效价在1：10^4—1：10^6，其中单抗4G4、2H4、GH9具有免疫荧光特性。ELISA特异性分析结果表明，4G4、2H4、FA4、GH9、CF2为嗜水气单胞菌血清型特异性单抗，4G4、2H4识别同一种血清型的嗜水气单胞菌分离株，而FA4、GH9、CF2却识别另外一种血清型的嗜水气单胞菌，并且与其他血清型的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应。Western-blot结果表明，单抗4G4、2H4、FA4所针对的抗原是菌体脂多糖(LPS)，且它们所识别的LPS抗原表位不同。菌体单抗研究结果表明，4G4、2H4和GH93株单抗可应用于嗜水气单胞菌的诊断和血清分型。本研究目的旨为建立一种快速诊断鱼类嗜水气单胞菌病的方法和血清分型方法。     

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。     

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。     

家兔苦马豆素多克隆抗体的制备及其对小花棘豆中毒的治疗效果

采用合成的苦马豆素(swainsonine,SW)人工抗原免疫接种家兔,获得高效价的SW抗血清,分离纯化得到的家兔SW多克隆抗体,复制家兔小花棘豆中毒模型,用SW多克隆抗体治疗小花棘豆中毒家兔,通过检测血清生化指标和免疫学指标,评价SW多克隆抗体治疗家兔小花棘豆中毒的效果。将18只家兔随机分为对照组(6只)、攻毒组(6只)和攻毒治疗组(6只),攻毒组和攻毒治疗组按照10g/(kg·d)的剂量饲喂小花棘豆,攻毒组试验兔出现死亡时(第70天)停止攻毒。攻毒第21天,攻毒治疗组试验兔注射SW多克隆抗体,每只兔每天1mL,连续注射4d。以攻毒试验开始为第0天进行首次采血,试验开始后每7d采血1次,进行血清免疫和生化指标测定。结果显示,攻毒第7天时攻毒家兔血清AKP活性和SW质量浓度显著高于对照家兔(P0.05);第14天时攻毒家兔血清AST和LDH活性显著高于对照家兔(P0.05),血清AMA活性和E-玫瑰花环率均显著低于对照家兔(P0.05);第21天时攻毒家兔血清BUN、CRE和GLU浓度显著高于对照组家兔(P0.05)。攻毒治疗组家兔注射SW抗血清后血清AKP、LDH、AST、ALT活性,BUN、CRE、GLU浓度和SW质量浓度较攻毒家兔显著下降,AMA活性和E-玫瑰花环率显著上升。说明,SW多克隆抗体可有效治疗家兔小花棘豆中毒。     

Protective immunity of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunberg, against experimental viral nervous necrosis

This paper describes the protective immune responses of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunberg, immunized with live piscine nodavirus, the causative agent of viral nervous necrosis (VNN), or the Escherichia coli – expressed recombinant coat protein. Nodavirus-neutralizing antibodies were detected at titres ranging from 1:158 to 1:1257 in serum of sevenband grouper which survived intramuscular injection with the virus, by a cell culture assay system. The virus-neutralizing ability of immune serum was also confirmed by injecting virus previously treated with serum into fish. This indicates establishment of acquired immunity in survivors and thus explains why survivors from natural infection are resistant to recurrence of the disease. Young sevenband grouper were immunized twice by intramuscular injections with the recombinant coat protein. Immunized fish produced neutralizing antibodies at high titres for at least 110 days and showed significantly lower mortalities in virus challenge tests. These results suggest the potential for vaccination against VNN in sevenband grouper, which is susceptible to piscine nodavirus at all life-stages.     

幼狐脑炎母源抗体消退情况监测

本研究采用微量中和实验的方法,对30日龄、45日龄、60日龄幼狐的传染性脑炎母源抗体进行检测。结果显示,30日龄幼狐的传染性脑炎母源抗体水平较高,中和抗体平均效价为1：48.3;在45日龄断乳期该母源抗体平均中和抗体效价显著下降到1：18.3;在60日龄该母源抗体基本消失,多数中和抗体效价低于1：2.9。实验结果表明,45-50日龄对幼狐进行传染性脑炎疫苗首免,能避开免疫空白期和母源抗体干扰,获得较好免疫效果。     

山羊IFN-γ基因的克隆表达与多克隆抗体制备

为获得山羊IFN-γ重组蛋白,提取山羊外周血淋巴细胞总 RNA,反转录得到 cDNA,以此为模板经PCR扩增获得IFN-γ的ORF区,构建重组克隆载体。经PCR扩增得到编码山羊IFN-γ成熟肽的基因序列,连入重组表达载体 pET-32a,转入 BL21（Codon Plus）感受态细胞中,测序并分析。重组表达载体经IPTG诱导后,对产物进行SDS-PAGE分析,并过镍柱纯化。用获得的纯化蛋白免疫家兔制备抗体。结果显示,编码山羊IFN-γ成熟肽部分的片段长432 bp;SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为34．9 ku,在30℃条件下,以0．3 mmol／L的IPTG诱导6 h,可得到大量可溶性表达的目的蛋白;间接 ELISA测定制得的多克隆抗体效价为1∶106。