嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡后鳜IgM基因表达量和抗体效价的变化

应用荧光定量PCR技术,研究了嗜水气单胞菌疫苗浸泡免疫后,鳜(Siniperca chuatsi)鳃、皮肤、脾脏和头肾中IgM基因表达量变化,同时应用ELISA检测皮肤黏液和血清中抗体滴度变化。结果显示:最早检测到IgMmRNA转录水平上调的是皮肤和鳃(第4天),而脾脏和头肾在第7天才达到高峰。IgM基因在头肾和脾脏中表达量较高(高峰值分别达到16.3和23.8),皮肤和鳃中的表达量较小(高峰值分别为4.3和8.6)。抗体效价方面,皮肤黏液中抗体滴度峰值出现时间较早(第7天),但抗体从开始形成到消失持续时间较短(28 d);血清中抗体滴度峰值出现时间较迟(第21天),但持续较长(42 d)。结果表明:浸泡免疫能够引发鳜机体和局部均出现免疫应答。从抗体滴度和IgM基因表达量方面考虑,系统免疫组织均高于黏膜免疫组织,表明前者是合成IgM的主要场所。从时间上比较,对抗原刺激最早做出应答的是皮肤黏膜和鳃,其后系统免疫才表现应答作用,这表明了局部黏膜能够在抗原入侵的早期起到抵制作用。     

约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜免疫效果评价

为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和抗体效价变化规律。结果表明,约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫后,鳜肝脏Lys基因表达量显著上调(P0.05),第48小时表达量达到峰值,是对照组的10.9倍(P0.05),直到第28天表达量仍显著高于对照组(P0.05)。同时免疫鱼血清Lys活性明显升高,第2天达到峰值,是对照组的4.35倍(P0.05),第6天与对照组水平相当;免疫鳜脾脏Ig M基因相对表达量从第7天开始上调并显著高于对照组(P0.05),至第28天其相对表达量为对照组的98.7倍(P0.05);而免疫鱼血清抗体效价在第7天开始高于对照组,第28天达到峰值(26)。免疫后第28天采用强毒株M168进行攻毒,结果显示,免疫组相对成活率显著高于对照组,其相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS)达85.9%。结果表明约氏黄杆菌减毒株M170可引起鳜特异性和非特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护效果。     

鳜黏膜淋巴组织结构的初步研究

采用组织学和电镜技术,应用HE常规染色方法、AB-PAS黏液细胞染色方法、免疫组织化学方法,对鳜(Siniperca chuats)黏膜淋巴组织的基本结构以及免疫相关细胞的形态、类型及其在黏膜淋巴组织中的分布情况进行了研究.结果表明,鳜的鳃弓、鳃小片基部、皮肤的表皮以及肠上皮中存在大量的黏液细胞,用AB-PAS染色方法将鳜黏液细胞分为6种类型;免疫组化方法可在鳃的血窦腔、皮肤的基底层以及肠黏膜层中检测到抗体分泌细胞的存在;透射电镜观察显示,黏膜淋巴组织中存在着黏液细胞、淋巴细胞、浆细胞、吞噬细胞、肥大细胞、朗罕氏细胞、嗜中性粒细胞等免疫相关细胞.结论认为,鳜黏膜淋巴组织具有完成免疫应答的细胞基础.     

灿烂弧菌灭活菌苗对美国红鱼免疫效果的研究

制备灿烂弧菌(Vibrio splendidus)福尔马林灭活菌苗,通过浸泡、注射和口服3种方式接种美国红鱼(Sci-aenops ocellatus),分别在接种免疫后第7、14、21、28、35天采鱼血,检测其血清抗体效价、溶菌酶活力和白细胞吞噬活性;第28天用1.0×108CFU/mL的灿烂弧菌悬液进行攻毒试验,检测菌苗的免疫效果。结果表明,各免疫组血清抗体效价在第21天达到峰值,且浸泡组和注射组的血清抗体效价高于口服组;在35d实验期内,各免疫组的血清溶菌酶活力有明显提高,各浸泡组和注射组于免疫接种后14d显著高于对照组(P<0.05);除浸泡3组外,其余各免疫组的白细胞吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)在免疫接种后14d均较对照组有显著差异(P<0.05);各组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用,以注射2组的免疫保护率最高,达77.8%。     

灿烂弧菌灭活菌苗对美国红鱼免疫效果的研究

制备灿烂弧菌(Vibrio splendidus)福尔马林灭活菌苗,通过浸泡、注射和口服 3种方式接种美国红鱼(Sciaenops ocellatus),分别在接种免疫后第7、14、21、28、35天采鱼血,检测其血清抗体效价、溶菌酶活力和白细胞吞噬活性;第28天用1.0×108CFU/mL的灿烂弧菌悬液进行攻毒试验,检测菌苗的免疫效果.结果表明,各免疫组血清抗体效价在第21天达到峰值,且浸泡组和注射组的血清抗体效价高于口服组;在35 d实验期内,各免疫组的血清溶菌酶活力有明显提高,各浸泡组和注射组于免疫接种后14 d显著高于对照组(P<0.05);除浸泡3组外,其余各免疫组的白细胞吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)在免疫接种后14 d均较对照组有显著差异(P<0.05);各组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用,以注射2组的免疫保护率最高,达77.8%.     

嗜水气单胞菌疫苗免疫效果研究

选取对鲤鱼毒力强的嗜水气单胞菌菌株制成灭活疫苗,研究疫苗的免疫保护效应.采用甲醛灭活制备疫苗,分别对鲤鱼进行注射和浸泡试验,测定白细胞吞噬活性、淋巴细胞转化能力、血清、皮肤黏液的抗体效价及活菌攻毒后的免疫保护率.结果表明,受免鱼各项指标均明显高于对照组,注射组免疫保护率达90%,其中浸泡组各项略低于注射组.嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲤鱼有显著免疫保护效应,可作为预防细菌性败血症感染的疫苗.     

鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证

将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg,尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS).结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50 ug/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50 μg/尾免疫组及100 μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50 μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48 h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%.研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好.     

银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答研究

以绵羊红细胞为载体,建立了检测银鲫血清抗体的间接血球凝集试验。用该方法研究了银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答一般规律。研究结果表明,疫苗免疫组在免疫７天后可以测到血凝抗体,２１天达到高峰值４０９６,然后开始下降,３５天时抗体滴度降为１６。加弗氏不完全佐剂疫苗免疫组亦在７天时可以测到血凝抗体,２１天达到１０２４,３５天时为２０４８,抗体维持在较高的水平。对鱼体免疫后的保护力进行测定,结果表明,两个免疫组分别在７天左右和１４天左右开始产生保护力。免疫保护力在鱼体免疫初期随着抗体滴度的增加而加强,随后在一段时间内保持在较强的水平,并不随抗体滴度的下降而减弱。浸泡免疫试验的结果亦表明,银鲫可以通过浸泡免疫获得免疫保护力。     

海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的初步研究

将海豚链球菌(Streptococcus iniae)淡水分离株TBY-1菌株灭活后制备成无佐剂和添加白油佐剂的疫苗,利用浸泡和腹腔注射复合免疫方式对罗非鱼(Oreochromis niloticus)进行免疫,比较其相对保护率及血清中抗体凝集效价,以评价佐剂的存在与否及免疫次数对海豚链球菌灭活疫苗的免疫效果的影响,同...     

鳜皮肤黏液IgM样蛋白的纯化

对经嗜水气单胞菌全菌疫苗浸泡免疫后的鳜皮肤黏液中的免疫球蛋白采用盐析法、重组蛋白A(HiTrap rProteinA Sepharose)亲和层析法及鼠抗鳜血清IgM单克隆抗体偶联的Sepharose 4B亲和层析法分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较。结果表明:50%硫酸铵溶液可以沉淀黏液中大部分蛋白,条带仍较多,约十几条,其中含有72 ku和29 ku的条带,因此仅可作为免疫球蛋白粗提的方法;Sepharose 4B亲和层析法所提取鳜黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72 ku和29 ku 2个条带(初步认为鳜黏液Ig的重链和轻链),与鳜血清IgM的重、轻链分子量相同;rProteinA亲和层析法所提蛋白除具有上述重链(72 ku)和轻链(29 ku)外,还含有43 ku的蛋白带(可能为鳜黏液Ig另外一种形式的重链)。Western-blot显示,兔抗鳜Ig多克隆抗体可与72 ku及43 ku条带发生发应。两种亲和法所提蛋白纯度较高,但含量较低,条带较淡,仅可作为实验室小量提纯鳜黏液Ig的有效方法。     

多种接种途径对翘嘴鳜细菌性烂鳃和败血症的免疫预防效果

多种接种途径对翘嘴鳜细菌性烂鳃和败血症的免疫预防效果陈昌福，周文豪（华中农业大学水产学院，武汉４３００７０）陈昌福等（１９９５）先后用从患细菌性烂鳃病的翘嘴鳜（ＳｉｎｉｐｅｒｃａｃｈｕａｔｓｉＢ．）上分离的柱状嗜纤维菌（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｏｌｕｍｎ...     

温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响

在9℃、15℃、21℃和26℃4种不同水温下,用淋巴囊肿病毒(LCDV)灭活疫苗腹腔注射牙鲆,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)研究了其皮肤黏液中特异性抗体水平的变化,以分析温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响.ELISA结果表明,9℃和15℃水温下牙鲆黏液OD值分别在注射LCDV后第9周和第7周达到峰值(9℃:OD=0.179; 15℃:OD=0.233); 21℃水温下OD值上升最快,5周达到峰值(0.316); 26℃水温下OD值较21℃无显著差异,也于5周达到峰值(0.295).采用硫酸铵分步盐析等技术粗提不同温度下OD值最高时的牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig),SDS-PAGE检测发现,各温度组黏液蛋白中均含有72 kD和26 kD蛋白条带.Western blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig重链的单克隆抗体只与黏液蛋白中72 kD条带发生反应,确定为牙鲆皮肤黏液Ig重链.综上结果表明,牙鲆在最适生活温度(21℃)下,抗体应答强度最大.牙鲆粗提黏液蛋白中Ig的初步确定,为探索牙鲆黏液免疫机制提供了材料.     

pH对大眼鳜和翘嘴鳜蛋白酶活性的影响

研究了不同pH值对大眼鳜消化道不同部位蛋白酶活性的影响及在最适pH条件下与翘嘴鳜消化道蛋白酶活力的差异。结果表明,大眼鳜消化道不同部位蛋白酶的活性强弱顺序为:幽门盲囊>胃>前肠>后肠,其最适pH分别是:10.4、2.8、9.5、10.1。翘嘴鳜的胃和幽门盲囊蛋白酶活力明显高于大眼鳜(P<0.01),而肠的蛋白酶活力略低,差异不显著(P>0.05)。     

鱼类粘膜免疫研究进展

Fish immunology has achieved great progress in recent years. While before 1990s, most researches focused on the fish systematic immunity, and the mucosal immunity of fish had not been given enough attention. Indeed, it has been shown that fish mucosal immunity plays an important role in disease defense. Fish mucosal immunity research has made some exciting progress in this decade. This review will focus on such progress: Constitution of mucosal-associated tissues and distribution of different immune cells, including T/B lymphocytes, granules, monocytes, macrophages, goblet cells, etc, in these sites have been well described with the development of some monoclonal antibody to these cells and associated techniques. Non-specific immune response mechanism of mucosal tissues reported these years, such as secretion of non-specific anti-bacteria and anti-fungi substances in mucus, the respiratory burst, enzyme activity of immune cells and so on, is believed important for fish disease defense. The specific immunity of mucosal tissues also attracts much interest and makes great achievement in antigen presenting, MHC genes, antibody producing and antibody secreting cells, comparison of serum and mucus immunoglobulin, relationships of immune response between different mucosal immune tissues. Whether mucosal immune system is independent of systematic immune system is another interesting question and causes great concern. In recent years, some evidences from phyletic evolution and ontogenesis show that mucosal immunity is prior to systematic immunity in evolution. Dynamics of antibody producing of mucosal tissues and serum in immersion or oral vaccines immunized fish also shows immune response can be elicited in mucosal tissues independent of systematic immune system. Some researchers also begin to pay attention to factors involved in mucosal immune regulations, for instance, neuromodulators and cytokines. The level of these factors changes in fish immune response process but the mechanisms of regulation still remain unknown. Prospect of the promising future of fish mucosal immunity has also been discussed in this review.     

高温季节鳜及饵料鱼池塘浮游生物调查研究

于高温多雨季节对广东省清远市鳜养殖基地的6个鳜（Siniperca chuatsi）及饵料鱼养殖池塘发病前后的浮游生物组成进行了调查分析。结果表明,易发病池塘,水中浮游生物总生物量比其他池塘略低。浮游植物优势种均为微囊藻（Microcystis sp.）,颤藻（Oscillatoria sp）等蓝藻。此外,池塘出现出血病症状时,浮游生物的马格利夫（Margalef）丰度指数和香农（Shannon-weaver）多样性指数均处于较低水平,这两项指数可作为池塘发病的预警参考指标。在实际生产中,平时应注意调节水质,以稳定水中浮游生物的数量和组成,在天气不佳时更应多加巡塘,以便及早发现病情。     

3种鳜鱼消化道结构与胃中泌酸胃酶细胞分布比较

利用石蜡切片技术比较了鳜鱼、斑鳜和杂交鳜(斑鳜♀×鳜鱼♂)胃、幽门盲囊、肠道结构特征。3种鳜鱼胃壁均由黏膜层、黏膜下层、肌层组成,黏膜层内能看到固有层;其中,鳜鱼、杂交鳜胃黏膜层相对厚度0.30±0.09、0.30±0.11,斑鳜胃黏膜层相对厚度较薄,约0.21±0.13。肠道由黏膜层、黏膜下层和肌层组成,黏膜层表面含有绒毛,绒毛层含有杯状细胞;鳜鱼与杂交鳜褶皱数、杯状细胞密度间差异不显著(P0.05),但显著大于斑鳜(P0.05)。鳜鱼、斑鳜和杂交鳜幽门盲囊平均数目分别为(2.138±0.173)个/μm2、(0.793±0.132)个/μm2和(1.098±0.218)个/μm2。幽门盲囊结构与肠道相似,3种鳜鱼的褶皱数目差异不显著(P0.05),但斑鳜杯状细胞密度显著小于鳜鱼和杂交鳜(P0.05)。同时,利用原位杂交技术比较了3种鳜鱼胃中泌酸胃酶细胞的分布特征,3个胃蛋白酶原基因探针均出现紫色杂交信号,且均位于胃黏膜层。同种鱼中,不同基因探针杂交信号细胞密度差异不显著(P0.05);不同种类间,相同基因探针杂交信号细胞密度大小顺序均为鳜鱼=杂交鳜斑鳜,且相互间差异显著(P0.05)。消化道结构与泌酸胃酶细胞分布差异为鳜鱼消化生理学比较研究提供了基础资料。     

Identification of a localized mucosal immune response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), following immunization with a protein-hapten antigen

The ability of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (RBT), to produce a localized mucosal immune response was investigated following intraperitoneal (i.p.) or peranal (p.a.) immunization with a protein-hapten carrier, fluorescein isothiocyanate conjugated to keyhole limpet haemocyanin (FITC/KLH). Antibody levels in serum, mucus, tissue culture supernatant from blood and spleen leucocytes, and excised skin, intestine and gill tissues were determined by ELISA. Significantly, elevated antigen-specific antibodies were elicited in both serum and mucus of fish immunized i.p. Mucosal antibody responses, in general, paralleled serum responses over time. Leucocytes isolated from spleen and blood of i.p. immunized fish at week 10 produced significantly elevated antibody levels against FITC when cultured in vitro. Excised skin, intestine and gill tissues from these fish also exhibited significantly elevated antibody responses indicating localized production in the mucosa from tissue-specific B cells. A localized mucosal immune response was elicited only after i.p. and not p.a. immunization, suggesting that systemically stimulated B cells migrate to mucosal tissues where they produce antibodies locally.