PGC-1α基因在两个品种鸡两种表型肌肉中的差异表达

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1 (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1 alpha,PGC-1α)是调控肌纤维类型转换的关键因子,已成为研究畜禽肌肉品质的一个热点基因.为探讨生长速度不同的两个品种鸡(Gallus gallus)生长发育早期两种表型肌肉中PGC-1α的表达情况,本研究利用qRT-PCR和Western blot分别检测PGC-1α mRNA和蛋白在慢生型清远麻鸡和速生型隐性白羽鸡的比目鱼肌(主要含慢肌纤维)和趾长伸肌(主要含快肌纤维)中的发育性(0,1,3,5,7和9周龄)表达变化.结果显示,同一种肌肉组织中PGC-1α mRNA均是0周龄时表达水平最高,显著高于其他各周龄(P＜0.05);肌肉组织中PGC-1α mRNA和蛋白表达趋势虽然均不相同,但其表达均与肌肉表型和品种相关,即相同周龄时,两个品种鸡的比目鱼肌中PGC-1α mRNA和蛋白表达均高于其趾长伸肌,两种表型肌肉中PGC-1α mRNA和蛋白表达均是清远麻鸡高于隐性白羽鸡,且在0周龄时,mRNA表达差异均极显著(P＜0.01).结果提示,鸡骨骼肌PGC-1α表达可能与慢肌纤维含量密切相关,并与鸡肉品质存在关联.研究结果有助于了解PGC-1α在鸡骨骼肌中的作用,并为改良鸡肉品质提供理论依据.     

山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1cDNA序列克隆及表达

试验旨在克隆山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列,探究其表达的组织特异性及其在小肠中的表达发育模式。参考GenBank已发表的绵羊、牛SLC3A1基因mRNA序列设计引物,克隆山羊SLC3A1基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR的方法分析其在1日龄山羊11种组织及其在1日龄、6月龄、8月龄、10月龄、12月龄山羊十二指肠、空肠、回肠中的mRNA表达情况。结果表明,成功克隆得到了山羊SLC3A1基因cDNA序列,其与绵羊、牛、野猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为99%、97%、88%、86%、80%和79%。SLC3A1基因转录表达有明显的组织特异性,其在1日龄山羊肾脏、回肠、空肠、结肠中表达量依次降低(P<0.05),其他组织中表达量很低。同一月龄山羊,SLC3A1基因在不同肠段的表达量数值上回肠>空肠>十二指肠。SLC3A1基因在不同月龄山羊十二指肠表达量以1日龄山羊为最高(P<0.05),6~12月龄山羊相同肠段之间表达量无显著差异(P>0.05);空肠表达量随山羊年龄的增加均呈现逐步降低的趋势;回肠表达量在各个月龄山羊之间差异不显著(P>0.05)。结果说明,山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1的主要表达部位在肾脏和肠道,推测b^0,+碱性氨基酸转运系统转运氨基酸的主要部位为肾脏和肠道。SLC3A1基因在山羊小肠受肠段和发育阶段的影响,具有不同的表达发育模式。     

多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化

【目的】针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究,用以优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）的条件。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有：①前期的质粒准备：首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”：以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”：以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化：按照MEGAclear^TM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA（EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg）和脂质体2000 的比例为1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组（P＜0.05）,且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组（山羊成纤维细胞正常生长组）。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。     

钙和水杨酸对亚适温弱光下黄瓜幼苗光合酶活性和基因表达的影响

为了探明钙和水杨酸对亚适温弱光下黄瓜幼苗光合作用的调控机理,以‘津优3号’黄瓜为试材,用10 mmol ? L-1氯化钙（CaCl2）和1 mmol ? L-1水杨酸（SA）喷施预处理幼苗,每天喷1次,连续3 d,之后置于光照培养箱内进行亚适温弱光处理（18 ℃/12 ℃,PFD 100 μmol ? m-2 ? s-1）。结果表明：亚适温弱光可使黄瓜幼苗生长量大幅度下降,光合速率（Pn）以及核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）、果糖–1,6–二磷酸酯酶（FBPase）、甘油醛–3–磷酸脱氢酶（GAPDH）、果糖1,6–二磷酸醛缩酶（FBA）、转酮醇酶（TK）的活性与其mRNA表达明显降低,但CaCl2和SA预处理的黄瓜幼苗的降低幅度明显较小,可见钙和水杨酸可以通过提高光合酶的活性及其基因表达,缓解亚适温弱光对黄瓜幼苗光合作用的影响,增强其对亚适温弱光的适应性。     

EGCG抑制Nicotine诱导肺腺癌H1299细胞JAK2/STAT3 mRNA的表达研究

为探索EGCG对Nicotine诱导肺癌细胞增殖的抑制作用,本研究通过MTT实验筛选出EGCG、Nicotine对肺腺癌细胞H1299的最佳作用浓度,利用实时荧光定量PCR技术检测EGCG、Nicotine对H1299细胞中Bax、Bcl-2、Jak2和Stat3基因mRNA相对表达量的变化。实验结果表明,EGCG对H1299细胞的半抑制浓度IC₅₀值约为32βμmol·L^-1（24βh）、15βμmol·L^-1（48βh）;1βμmol·L^-1的Nicotine对H1299细胞促增殖作用明显;以15βμmol·L^-1的EGCG预处理H1299细胞24βh可显著下调1βμmol·L^-1 Nicotine的促增殖作用（P<0.05）。1βμmol·L^-1的Nicotine处理H1299细胞可明显降低JAK2/STAT3信号通路中Bax基因mRNA的表达,增加Bcl-2、Jak2、Stat3基因的mRNA表达;15βμmol·L^-1 EGCG预处理H1299细胞可反向调控Nicotine诱导所致JAK2/STAT3信号通路中Jak2、Stat3和Bax、Bcl-2基因表达量的变化,结果具有显著性差异（P<0.05）。由此可知,EGCG对Nicotine诱导的肺腺癌H1299细胞增殖及JAK2/STAT3信号通路中促增殖基因mRNA的表达起抑制作用。     

3种品系尼罗罗非鱼生长及高密度胁迫后生理响应变化的比较

以‘吉富’、‘新吉富’、‘埃及尼罗’3种不同品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为研究对象, 通过不同品系之间生长与高密度胁迫反应的比较, 探讨3种尼罗罗非鱼的生长特点与应激后生理响应的变化规律。将初始规格基本一致的3种品系尼罗罗非鱼饲养100 d后, 吉富罗非鱼特定生长率最高, 新吉富其次, 两者间无显著差异(P>0.05), 埃及尼罗罗非鱼特定生长率显著低于吉富罗非鱼(P<0.05)。吉富与新吉富罗非鱼的内脏比显著高于埃及尼罗(P<0.05); 3种尼罗罗非鱼的肥满度之间无显著差异(P>0.05)。养殖实验结束后, 进行48 h的急性高密度(100 g/L)应激实验。应激48 h内, 吉富与新吉富罗非鱼血清总蛋白、葡萄糖、谷草转氨酶、胆固醇与溶菌酶活力/水平以及肝HSP70mRNA水平呈先上升后下降的变化。应激48 h后, 埃及尼罗罗非鱼血清皮质醇水平与应激前相比无显著差异(P>0.05), 吉富与新吉富罗非鱼的皮质醇水平显著高于应激前(P<0.05); 埃及尼罗罗非鱼血清溶菌酶活力与肝HSP70 mRNA水平在应激后48 h内始终高于应激前(P<0.05)。研究结果表明, 短期高密度胁迫可提高3种尼罗罗非鱼血清葡萄糖与甘油三酯的利用, 并诱发肝损伤。埃及尼罗罗非鱼的抗高密度应激能力高于吉富和新吉富罗非鱼。

     

mRNA差异显示技术及其改进

分子生物学的首要任务之一就是比较不同细胞间或同一细胞不同时间与空间基因表达的差异。在多种基因检测技术中 ,mRNA差异显示技术作为研究细胞、组织在不同条件下 ,基因表达水平差异的重要手段 ,以不可替代的优势已被广泛用于生物学领域。该技术与传统的消减杂交等方法进行比较具有简便、快捷、灵敏、高效等优点 ,但也存在假阳性率高、易污染等缺点。为了克服以上缺点又不断涌现出一些改进技术。文章对该技术的原理、优势与不足及主要改进进行了综述     

血清对猪前脂肪细胞分化过程中聚脂相关基因表达的影响

为了探讨血清对猪前脂肪细胞诱导分化的影响,筛选更优的诱导方法.采用胶原酶消化法分离猪皮下前脂肪细胞,用含50 nmol·L~(-1)胰岛素、100 nmol·L~(-1)地塞米松、0.25 mmol·L~(-1)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100nmol·L~1罗格列酮及添加(对照组)或不添加(试验组)10%FBS的分化培养液1和2对前脂肪细胞进行诱导分化,借助实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因PPARα、C/EBPα、FASN、ACOX1、GPAT和ENPP2的表达模式.结果显示:血清对PPARγ和FABP4两基因的表达有极显著的上调作用(P<＜0.01),而对其他6个基因的表达有极显著的下调作用(P＜0.01).试验组中FASN、GPAT和ACOX13个基因诱导分化各时间点的综合表达景均极显著高于对照组(P＜0.01),3基因表达量变化趋势间均达到极显著相关(P＜0.01).试验组中PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX1 4个基因的基因表达最变化趋势间均达到显著或极显著正相关.研究表明:前脂肪细胞分化过程中,细胞内脂肪酸的生物合成和β氧化均在发生,细胞内脂肪含量积聚的快慢取决于2个途径力量的对比;PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX14个基因间存在极强的协同表达现象;在细胞内脂肪积聚快慢上,含血清的分化培养液1要优于不含血清的分化培养液2.