phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建

直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板，对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增，再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒，经DNA测序鉴定正确后，亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e，成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建，为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。     

鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达

对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒，进行EcoR Ⅰ和Sα／Ⅰ双酶切，获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。提取质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确，从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，证明其分子质量约为29ku；Western-blotting分析表明，该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别，具有生物学活性。     

禽流感的研究进展

禽流感(Avian influenza，AI)又称鸡瘟(Fowl plague)、真性鸡瘟、欧洲鸡瘟，是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒(AIV)引起的禽类的一种传染性疾病，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野生鸟类均可感染。因宿主和病原的不同，发病情况多种多样。高致病性禽流感病毒可引起鸡群中100％的     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。     

大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位基因的克隆与鉴定

根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位(FedF／ab)的基因(fedF／ab)序列，设计了1对引物，利用PCR技术从大肠埃希氏菌F107／86、YCED1、YCED2、C、D和12F株中分别扩增获得了一段序列，并克隆至pGEM—T载体，获得了重组质粒TF107F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析，6个重组质粒的大小均为903bp，与fedF／ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F107／86、YCED1、C和12F株的fedF基因序列完全相同；只有YCED2株在第181位碱基处存在1个C→T的无义变异差异，D株在第655位碱基处存在1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现1个S→P变异。结果表明，所克隆的序列均为F18ab菌毛F亚单位的基因。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物，用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架(ORF)后克隆至表达载体pET-32a( )，构建了重组表达质粒pET-32a( )-cSZ1，并将其转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经IPTG诱导，获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达，表达产物量可达菌体总蛋白的9．3％，融合蛋白的分子质量约为40ku。重组菌诱导表达的产物经SDS—PAGE后，用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析，结果为阴性，提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

其它疫情

蓝舌病，禽流感，口蹄疫，水疱性口炎，副流感病毒感染     

马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的克隆和序列分析

参考GeneBank发表的马立克氏病病毒(MDV)国际标准强毒株GA的基因序列，设计合成一对引物，分别以RBIB，814，GD2(广东分离株)，J-1-E(北京分离株)，Md11，Md5，CV1988等不同毒株的MDV基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得了预期大小的PCR产物。该产物经pGEM-T-easy克隆后测序，将所得序列进行比较分析。结果发现：不同毒株间pp38基因的启动子和增强子序列间有缺失突变，序列的同源性大于95．9％，其中大多数的突变发生在MDV复制的原点附近。     

猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM-T easy载体上，测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域，切出目的基因，将目的基因克隆到表达质粒pProEX—HTb中，获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确，SDS—PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白，Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。