柿属植物ISSR分析技术的建立

以部分柿属(Diospyros)植物为材料,对ISSR-PCR反应体系腗g2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶浓度,退火温度及扩增循环次数进行了探讨,确立了适合柿属植物ISSR分析技术体系在25 μL反应体系中,含1× Buffer,Mg2+2.0或2.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.6 μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,甲酰胺2%,模板DNA 2.4 ng/μL;PCR扩增程序94℃变性3 min;94℃ 30 s,(Tm+2)℃(根据引物不同设定)45 s,72℃1.5 min,35个循环;72℃延伸7 min;2%琼脂糖电泳分离PCR产物.结果为柿属植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持.     

应用PCR技术检测HBsAg携带者血清中HBV DNA

应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增38例 HBsAg 携带者和58例正常人血清中的HBV DNA 特异性片段,通过与 HBsAg 滴度及 HBV 血清标志物进行对比分析发现 HBV DNA 阳性率与 HBsAg 滴度呈正相关(r=0.981,p<0.005),与 HBeAg 减低,抗-HBe 产生以及其后的 e系统消失过程呈相应递减趋势。并且在单项抗-HBs 阳性的血清中,HBVDNA 检出率可达10%。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

PCR在食品微生物检测中的应用

PCR即聚合酶链式反应,现在已广泛应用于环境、化工、医药、食品等各个领域,本文主要叙述了PCR技术在食品微生物检测方面的应用,并详细阐述了PCR技术的基本原理。也提出了目前PCR技术在食品微生物检测中存在的问题。     

甘蓝型油菜籽粒RNA提取方法的探讨

用CTAB法、SDS法、上海华瞬植物叶RNA抽提试剂盒分别提取甘蓝型油菜花后40 d的籽粒RNA.用电泳法和A260/A280与A260/A280的比值比较提取RNA的质量.结果发现:用SDS法、上海华瞬植物叶RNA抽提试剂盒都没有成功提取RNA,只有CTAB法成功地提取出了完整的甘蓝型油菜籽粒RNA.用CTAB法提取的总RNA的A260/A230与A260/A280的值分别为2.06和1.94,说明采用该方法提取的RNA污染小,纯度较高,获得的RNA产量也较高.通过逆转录实验和基因片段的克隆也证明获得的RNA质量比较高,可以直接满足一般的分子实验.     

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

[目的]建立一种能区分猪瘟病毒（classical swine fever，CSFV）强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法。[方法]根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列，选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物，并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物，建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。[结果]应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段，但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0．04pg的CSFV RNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测，结果表明，有14份类似猪瘟强毒，1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。[结论]本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒，减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。     

犬瘟热病毒反转录—聚合酶链反应检测方法的建立及初步应用

根据 Gen Bank中 Barrett报道的犬瘟热病毒弱毒株 Onderstepoort的血凝蛋白基因序列 ,设计合成了一对能扩增 76 0 bp基因片段的引物。用异硫氰酸胍 -酚 -仿一步抽提法提取细胞总 RNA进行反转录 ,再以此产物为模板进行 PCR扩增 ,筛选出最佳扩增条件。结果以此对引物进行 PCR扩增能得到与设计片段大小相同的产物 ,并且不扩增犬细小病毒、犬 I型腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验证实 ,此法能扩增出稀释 1 0 0 0倍的 CDV强毒细胞培养物 ( 1 0 5 .1 TCID5 0 /0 .1 ml)的反转录产物 ,其敏感性远高于电镜负染和荧光抗体染色法。经初步应用表明 ,此法可用于犬瘟热的临床诊断和实验研究。     

中草药青蒿(Artemisia annua L.)的实时荧光PCR检测

中草药青蒿,学名黄花蒿(Artem isia annuaL.),属于中国独有的抗疟药用植物资源之一。根据蒿属植物rDNA ITS序列多态性设计TaqM an探针及引物,通过实时荧光PCR方法对黄花蒿进行检测。结果表明:该组探针-引物对黄花蒿有很强的特异性,除黄花蒿外,其余8种对照蒿属材料均未检测到荧光信号。该方法快速、简便、安全、准确,适用于黄花蒿的出入境检验。     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

以水稻广陆矮４号为材料，利用ＰＣＲ技术从水稻基因组中扩增出１０ｋＤ富硫醇溶蛋白基因，并将其插入质粒ｐＵ１８的Ｓｍａ Ｉ位点，导入大肠杆菌ＪＭ１０９中筛选重组子。经酶切鉴定、ＰＣＲ检测获得含目的基因的克隆。采用银染测序法进行序列分析。结果表明，克隆的基因含４０２ｂｐ的ＯＰＦ，与Ｍａｓｕｍｕｒａ发表序列的同源率为８７．３％，编码１３３个氨基酸，包括２４个氨基酸的信号肽序列，推测的氨基酸序列与Ｍａｓｕｍ     

犬细小病毒病的PCR临床诊断研究

建立犬细小病毒聚合酶链式反应(PCR)检测方法,并应用于临床诊断.根据犬细小病毒基因保守序列设计一对特异性引物,扩增目的片段大小为448bp.用此引物扩增疫苗中的犬细小病毒和37份病料中的犬细小病毒,并与胶体金诊断试剂盒相对比.实验结果显示:该方法能从疫苗中和临床病料中扩增出犬细小病毒目的基因片段,与胶体金诊断试剂盒相比能克服免疫血清学诊断中的非特异性反应,具有快速、准确、灵敏度高的优点,完全适用于犬细小病毒病的临床诊断.