禁食对大口黑鲈生长和肝脏IGF-ⅠmRNA表达丰度的影响

运用实时荧光定量PCR技术,研究禁食对体质量为（100±1）  g 的1龄大口黑鲈（Micropterus salmoides）的生长和肝脏中类胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA表达丰度的影响。在为期6周的实验期间,对照组每天表观饱食投喂2次;禁食组禁食3周后恢复投喂3周。实验期间对照组鱼体质量和体长逐渐增加。6周后,对照组鱼体增重率为10.99%,体长增加率为3.07%。禁食组禁食3周期间,鱼体质量下降了5.08%、体长减少了1.79%。同时肝组织IGF-ⅠmRNA表达水平呈下降趋势,禁食结束时仅为对照组的29.93%。恢复投喂2周后肝组织IGF-ⅠmRNA的表达量仍显著低于对照组（P <  0.05）,鱼体质量为实验初始水平的98.54%,体长为实验初始水平的99.03%;恢复投喂3周后,禁食组鱼体质量、体长恢复到实验初始时水平（P  >  0.05）,但仍与对照组有显著差异（P <  0.01）;肝组织IGF-ⅠmRNA的表达丰度与对照组无显著性差异（P  >  0.05）。结果显示,禁食使大口黑鲈体质量、体长下降,同时肝组织IGF-ⅠmRNA表达丰度也随之降低;而恢复投饲后,其生长、肝脏IGF-ⅠmRNA的表达丰度也逐渐恢复。研究表明,鱼类的营养状况、生长和与IGF-ⅠmRNA的表达之间存有正相关关系。     

转基因与野生唐鱼耐温限度及窒息点的比较研究

对转红色荧光蛋白基因唐鱼、野生型唐鱼Ⅰ和野生型唐鱼Ⅱ的耐温和耐氧能力进行比较研究。结果表明,在驯化温度为30 °C,升温速率为1 °C / h时,三种唐鱼的半致死高温分别为：38.53±0.08 °C、38.28±0.29 °C和38.55±0.09 °C。在驯化温度为25 °C,降温速率为2 °C / 24h时,三种唐鱼的半致死低温分别为：1.13±0.40 °C、1.26±0.10 °C和1.21±0.12 °C。恒温25 °C时,测定三种唐鱼的窒息点分别为：0.66±0.02 mg/L、0.74±0.21 mg/L和0.51±0.01 mg/L。差异显著性检验表明,三种唐鱼对温度和溶氧的耐受力无显著性差异。     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明,半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％,与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树,获得的进化树表明,半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类,亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

海带孢子体光合活性对不同温度和光照的响应

为了从生理生态学角度解答温度和光照对海带孢子体生长过程的影响,探索海带孢子体对温度和光环境的生理响应机制,实验在测定养殖海域海带孢子体生长参数的基础上,设定了6、10、14和18°C 4个水温梯度的海带孢子体暂养实验,以及它们在0、25、70、133、230、317、421、582、786μmol photons/(m2·s) 9个光合有效辐射(PAR)梯度下的光合活性荧光参数测定。结果显示:①在6°C水温条件下,海带孢子体荧光参数Fv/Fm和Fv/F0最大,分别为0.71和2.40;在18°C水温条件下,其Fv/Fm和Fv/F0最小,分别为0.65和1.85;②暂养海带孢子体的光化学淬灭(qP)和非光化学淬灭(qN或NPQ)在18°C水温条件下达到最大,分别为0.92和3.29;③海带孢子体的快速光曲线随着光合有效辐射(PAR)的增强呈现先上升后下降的趋势;④海域养殖海带孢子体的最大叶长增长速率、叶宽增长速率和干重增重率分别为1.34 cm/d、0.33 cm/d和1.01 g/d。研究表明,海带孢子体干重生长率变化与不同水温条件下的快速光曲线变化一致,高温抑制了海带孢子体光合效率;当环境光合有效辐射大于样品光饱和点(Em)后,海带孢子体相对电子传递速率下降,光合作用受到抑制。     

半滑舌鳎创伤弧菌分离鉴定及其荧光定量PCR方法的建立

为确定患病半滑舌鳎的病原,从其体内分离到3株革兰氏阴性菌,将其分别命名为ST-1、ST-3和ST-6,进行细菌理化特性、药敏试验、16S rDNA测序以及组织病理学观察等方面的研究,并建立了外膜蛋白(OMP)基因的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,3株分离菌株的理化特性符合创伤弧菌特征,16S rDNA与创伤弧菌标准菌株ATCC29307序列相似性达99%以上,系统发育树分析显示,3株分离株与创伤弧菌自然聚为一支,最终鉴定为创伤弧菌;药敏试验显示,3株菌对头孢克肟、头孢哌酮、链霉素、亚胺培南和氟苯尼考等药物高度敏感。人工回归感染试验表明,分离株具有致病性,且半滑舌鳎、斑马鱼的临床症状与自然患病鱼症状相似;组织病理学观察显示,鳃丝上皮细胞增生,鳃小片肿胀黏连、颗粒细胞和黏液细胞增多,肝脏中央静脉淤血,肾脏出血、坏死,肠道黏膜固有层萎缩、黏液细胞增多等。进一步建立OMP基因的荧光定量PCR方法,结果显示,标准曲线的相关系数为0.995,检测下限为1.88×10~2 CFU/mL。以上结果可为半滑舌鳎弧菌病的致病机理、分子诊断和防治提供科学参考。     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒三种定量检测方法的比较与评价

为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)三种方法来对GCRV-Ⅱ进行检测和含量测定,从特异性、敏感性、可靠性和检测结果的相关性来比较这三种方法对于GCRV-Ⅱ定量检测的差异。结果显示:qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV-Ⅱ的最低限分别为8.6、86和86拷贝/μL,qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级;特异性分析表明,qPCR、IPMA和IFA三种方法均只能检测出GCRV-Ⅱ型分离株,而其它病毒和未感染病毒的阴性对照细胞均为检测阴性,表明这三种方法均具有较高的特异性;3种方法分别检测60份已知临床样品,qPCR、IPMA和IFA的诊断敏感性和特异性分别为96.7%(29/30)和100%(30/30)、100%(30/30)和93.3%(28/30)及100%(30/30)和100%(30/30);三种方法对于GCRV-Ⅱ的定量检测结果中病毒拷贝数和病毒滴度之间具有较好的相关性,其拟合曲线分别为:Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=23.629X-536 174(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.996)、Y(IFA,TCID_(50)/mL)=20.318X-575 062(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.995)和Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=1.161X-1 176(IFA,TCID_(50)/mL)(R~2=0.999)。结果表明,GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定,除了用IPMA和IFA外,也可以采用qPCR方法通过测定病毒的核酸拷贝数来测算其病毒滴度。     

三氯生对雄性斑马鱼鳃组织凋亡相关基因表达的影响

为探究三氯生(TCS)对于硬骨鱼类的凋亡相关基因表达的影响,以雄性斑马鱼(Danio Rerio)为试验动物,采用半静态水体接触染毒法,将斑马鱼分别置于质量浓度为17、34和68μg/L的TCS溶液中,并设计空白对照组,42 d后,对鳃组织进行采样,利用普通PCR和RT-qPCR技术分析雄性斑马鱼鳃组织凋亡基因Bcl-2、Bax、MDM2、p53的表达量。研究发现,与空白对照组相比,Bax和p53基因在TCS处理组中的表达量都出现了下调趋势,且在68μg/L的TCS处理组中表达水平显著下调;Bcl-2在各TCS处理组中无显著变化;MDM2基因在34μg/L和68μg/L TCS处理浓度组中表现为极显著上调。研究结果表明:高浓度TCS对雄性斑马鱼鳃组织凋亡相关基因的表达具有一定的影响。     

水产养殖池塘底泥中氟喹诺酮类抗生素的检测方法研究

采用固相萃取-高效液相色谱荧光法,建立了水产养殖池塘底泥中两种氟喹诺酮类抗生素(恩诺沙星、环丙沙星)的检测分析方法,优化了样品的前处理方法及色谱条件。通过对比4种不同提取液发现,选用50%Mg(NO_3)_2-10%NH_3·H_2O(96∶4,v/v)为提取液时,底泥中恩诺沙星和环丙沙星的回收率较好,分别为74.9%～90.8%和68.1%～89.6%;提取液使用量为5 mL时,底泥中两种抗生素的回收率最高;在不同浓度加标条件下,两种抗生素的回收率均比较稳定。样品过HLB小柱富集净化后,用酸化乙腈洗脱。洗脱液的浓缩方式,氮吹效果优于旋转蒸发。对水产养殖池塘沉水性植物栽种前后的底泥样品进行分析检测,结果表明,本方法的检测值平行性好,能够满足实际样品的分析要求。     

拟穴青蟹不同发育时期胚胎基因表达的内参基因的筛选

为获得适用于研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)不同发育时期胚胎基因表达的内参基因,本研究采用3个内参基因筛选软件geNorm、NormFinder及BestKeeper对微管蛋白α1A(Tuba1a)、核糖体蛋白L13(Rpl13)、泛素(UBQ)、核糖体蛋白S6激酶(Rps6)、精氨酸激酶(Ak)、3-磷酸甘油脱氢酶(gapdh)、28S核糖体RNA(28S)、18S核糖体RNA(18S)和延伸因子1A基因(EF-1α)等9个常用候选内参基因在拟穴青蟹不同发育时期胚胎的表达稳定性进行分析。geNorm分析表明, EF-1α和Rpl13的表达稳定性最高,并且采用2个内参基因同时校正目标基因的定量结果可以达到最优效果; NormFinder分析表明, gapdh和EF-1α是9个候选内参基因中表达最稳定的; BestKeeper分析表明,gapdh的标准偏差和变异系数是9个候选基因中最低的。综合3个内参基因筛选软件,可以选用EF-1α,或选用EF-1α和gapdh双内参同时校正拟穴青蟹不同胚胎发育时期各基因的表达情况。     

不同种类浮游植物对CO2浓度升高的响应

本研究采用实验生态学的方法,以金藻、硅藻、绿藻3个门中的4种常见饵料藻叉鞭金藻(Dicrateria sp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)为研究对象,分析比较不同浮游植物的细胞数量和质量对CO2浓度升高引起的海水酸化的响应情况。结果显示,与对照组相比,(1) CO2浓度升高显著提高了这4种藻的生长速率(P<0.05);其中,亚心形扁藻平均比生长速率最高,比对照组高出13.5%;小球藻次之,为5.9%;叉鞭金藻和三角褐指藻均为2.2%。(2) CO2浓度升高使浮游植物细胞内的碳(C)含量增加、氮(N)含量降低,C/N提高;种间差异较大,其中,亚心形扁藻的C/N、C/P值、小球藻的C/P值和三角褐指藻的C/N值显著提高,叉鞭金藻不显著。(3) CO2浓度升高使小球藻单位细胞叶绿素a含量显著提高,小球藻通过提高光合作用能力促进生长,而另外3种藻叶绿素a含量与对照组无显著差异;三角褐指藻最大光化学量子产量(Fv/Fm)在实验初期显著升高;叉鞭金藻非光化学淬灭(NPQ)显著降低,快速光曲线初始斜率(α)显著增加;三角褐指藻和亚心形扁藻潜在的最大光合作用能力(rETRmax)显著升高(P<0.05),但CO2浓度升高对4种藻的光化学淬灭(qP)均没有显著影响(P>0.05)。可见,亚心形扁藻、小球藻和三角褐指藻在高CO2浓度下虽然生长速率加快,但营养质量降低。不同种类的浮游植物对CO2浓度升高的响应不同,这种差异可能会使未来海洋浮游植物群落结构发生变化;浮游植物C/N、C/P值的改变可能通过食物链对次级生产者,诸如浮游动物、滤食性贝类等产生影响。